習(xí)瓚娜,裴江蘭,甄永康,王夢(mèng)芝

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,中國(guó)江蘇 揚(yáng)州 225009）

晝夜節(jié)律存在于生物體內(nèi)多種生理生化過程中,調(diào)節(jié)機(jī)體環(huán)境與生理過程之間的相互作用,使生物體能更好地適應(yīng)外界環(huán)境的節(jié)律改變[1]。研究表明,晝夜節(jié)律能夠調(diào)控生物體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝,并影響各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能[2～3]。例如:大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,葡萄糖攝取具有明顯的24 h節(jié)律[4];小鼠腸道中肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（peptide transporter 1,PEPT1）的表達(dá)具有節(jié)律性[5];芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白樣1（brain and muscle ARNT-like 1,Bmal1）基因被證明可以調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)吸收的節(jié)律[6]。晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)多種胃腸功能,包括細(xì)胞增殖、免疫穩(wěn)態(tài)、腸道通透性及微生物的平衡和代謝[7～12]。晝夜節(jié)律的破壞會(huì)造成多種生理功能的失調(diào),對(duì)生物體的健康產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響。比如:Bmal1突變的小鼠和Clock（circadian locomotor output cycles kaput）突變的小鼠的胃腸都表現(xiàn)出細(xì)胞增殖的紊亂[8～9];Per1（Period1）和 Per2（Period2）基因敲除小鼠的腸道微生物的節(jié)律消失,晝夜節(jié)律被打亂,導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[10～12]。此外,晝夜節(jié)律紊亂會(huì)增加消化系統(tǒng)疾病的易感性,如腸道炎癥、十二指腸潰瘍、腸應(yīng)激疾病和胃腸癌癥[13～14]。相關(guān)研究報(bào)道,結(jié)腸癌組織中存在Clock基因的突變[15];在小鼠中,晝夜節(jié)律紊亂損害腸道屏障的完整性[16];敲除Clock或Cry（cryptochrome）基因的小鼠比野生小鼠產(chǎn)生更多的促炎細(xì)胞因子[17];與白班工人相比,夜班工人感染胃炎和消化性潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)較高[18]。因此,晝夜節(jié)律在胃腸中發(fā)揮重要作用,進(jìn)一步研究生物鐘與消化道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝之間的關(guān)系,對(duì)調(diào)控機(jī)體健康有一定的參考意義。

1 消化道晝夜節(jié)律系統(tǒng)及其對(duì)消化循環(huán)的影響

沿胃腸道布的營(yíng)養(yǎng)傳感器可釋放大量影響胃腸功能、營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)和能量平衡的信號(hào)肽[19]。Furuya和Yugari首先在1974年證明了腸道吸收在大鼠中表現(xiàn)出晝夜節(jié)律[20～21]。與早餐后的消化率相比,晚餐后的消化率和腸吸收率要低[22]。研究表明,消化道存在生物鐘基因,這些生物鐘基因參與胃腸功能和活動(dòng),如胃排空、結(jié)腸蠕動(dòng)、胃液分泌和酶的活動(dòng)[7,23]。Bmal1通過調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)腸上皮24 h節(jié)律的產(chǎn)生[8]。敲除Per1或Per2會(huì)改變結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)節(jié)律,同時(shí)敲除Per1和Per2可使小鼠結(jié)腸活動(dòng)的晝夜節(jié)律消失[24]。有研究發(fā)現(xiàn),嚙齒動(dòng)物的生物鐘基因在胰腺中也以晝夜節(jié)律的方式表達(dá)。針對(duì)缺乏生物鐘基因Bmal1的小鼠胰腺進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)小鼠存在嚴(yán)重的葡萄糖不耐受和胰島素分泌缺陷[25～26]。目前,胰酶淀粉酶和胰蛋白酶分泌的晝夜節(jié)律變化在人類受試者中已被報(bào)道[27]。此外,胰島素分泌率也被證明有晝夜節(jié)律性,其中血漿胰島素水平在清晨增加,下午達(dá)到峰值,晚上下降[28]。由此可見,消化道的生物鐘基因以晝夜節(jié)律的方式表達(dá),它們可能是胃腸活動(dòng)的重要調(diào)控因子。

2 晝夜節(jié)律與消化道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝

晝夜節(jié)律系統(tǒng)在營(yíng)養(yǎng)吸收方面起著重要作用,正常的生物鐘系統(tǒng)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。腸道生物鐘的破壞會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與節(jié)律性,Pan等[29]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠小腸中,轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA表達(dá)具有晝夜節(jié)律,而這些營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晝夜節(jié)律在Clock突變小鼠中消失,并且Clock突變小鼠吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量也發(fā)生了改變,這說明生物鐘調(diào)控著腸道內(nèi)多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.1 葡萄糖吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機(jī)制

碳水化合物主要由單糖（葡萄糖、果糖和半乳糖）、二糖（乳糖和蔗糖）和多糖（淀粉和纖維素）組成。多糖通過小腸刷狀緣水解酶的作用分解為單糖,腸腔中的單糖被腸上皮細(xì)胞吸收,這些單糖通過腸上皮細(xì)胞基底外側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從漿膜側(cè)輸出到腸上皮細(xì)胞外,進(jìn)入血液循環(huán)[30]。鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（sodium/glucose cotransporter 1,SGLT1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（glucose transporter 2,GLUT2）和GLUT5是存在于嚙齒動(dòng)物小腸中的主要己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它們協(xié)同促進(jìn)腸道中葡萄糖的吸收[31]。

大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,無論是在實(shí)驗(yàn)前1 h禁食還是按照預(yù)定的喂養(yǎng)方案喂食,葡萄糖攝取都表現(xiàn)出明顯的24 h節(jié)律[4],這表明在正常喂養(yǎng)條件下,葡萄糖攝取的晝夜節(jié)律與進(jìn)食模式無關(guān),可能由視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）中的晝夜節(jié)律系統(tǒng)調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),Sglt1的mRNA表達(dá)具有明顯的晝夜節(jié)律[32～33]。此外,Glut2和Glut5的表達(dá)也具有節(jié)律性[34～35]。染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Bmal1與己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的啟動(dòng)子結(jié)合[35]。以上信息提示,Bmal1可能直接調(diào)節(jié)基因Sglt1、Glut2和Glut5的表達(dá),己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控直接受時(shí)鐘基因的控制。

O′brien等[19]在研究鼠胃腸道糖傳感器相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn),甜味受體（Tas1r2,Tas1r3,Gnat3,Gnat1）、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sglt1,Glut2,Glut5）和特定糖傳感器（Slc5a4a,Slc5a4b）基因的表達(dá)水平分別在舌頭、近端與遠(yuǎn)端小腸中最高,生物鐘基因（Cry2/Bmal1）在所有研究區(qū)域均可檢測(cè)到活動(dòng),盡管SGLT3蛋白的表達(dá)未檢測(cè)到節(jié)律性,但是Slc5a4a和Slc5a4b基因的表達(dá)分別在小腸和胃中顯示出明顯的晝夜節(jié)律性,同時(shí),Tas1r2、Tas1r3和Gnat1在近端小腸中也表現(xiàn)出明顯的表達(dá)節(jié)律。這說明,胃腸道糖傳感器基因可能受生物鐘基因調(diào)控,生物鐘基因與營(yíng)養(yǎng)素相互作用。

2.2 脂質(zhì)吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機(jī)制

生物鐘在調(diào)節(jié)腸細(xì)胞的脂質(zhì)吸收中也起重要作用,越來越多的研究表明,晝夜節(jié)律紊亂會(huì)增加脂質(zhì)積累的風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致脂質(zhì)吸收受損[36～37]。脂肪從腸腔攝取到腸細(xì)胞的主要步驟是膽汁乳化、脂肪酶水解和轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取[38～44]。脂肪酸通過脂肪酸結(jié)合蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,脂肪酸用于合成三酰基甘油、磷脂和膽固醇酯,這些脂質(zhì)被包裝成稱為乳糜微粒的脂蛋白[45～46]。乳糜微粒是非常大的富含三?；视偷那蛐晤w粒,含有磷脂和膽固醇,這些顆粒的表面覆蓋有磷脂單層、游離膽固醇和幾種載脂蛋白。乳糜微粒組裝需要兩種蛋白質(zhì):載脂蛋白B（apolipoprotein B,ApoB）和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein,MTP）。

有研究表明,脂質(zhì)的吸收在24 h內(nèi)差異顯著,Clock的過表達(dá)會(huì)顯著降低Mtp的表達(dá)[29,47]。CLOCK:BMAL1異二聚體有節(jié)奏地激活小異二聚體伴侶（small heterodimer partner,SHP）,從而抑制Mtp的表達(dá)[47]。相關(guān)研究報(bào)道,小鼠在夜間吸收的甘油三酯和膽固醇含量明顯高于白天,并且甘油三酯和膽固醇的吸收與ApoB和MTP的表達(dá)表現(xiàn)出相關(guān)的晝夜波動(dòng)[48];小鼠小腸中有晝夜節(jié)律因子Noc（nocturnin）的表達(dá),與Noc+/+小鼠相比,Noc-/-小鼠吸收更少的甘油三酯和膽固醇[49～50];Noc的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游具有E-box,而CLOCK:BMAL1異二聚體可與這些序列直接結(jié)合[51]。這些研究表明Clock參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的日常調(diào)控。

此外,Pan等[29]在正常晝夜循環(huán)和自由獲取食物的條件下,還研究了其他參與脂質(zhì)合成和吸收的基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)二脂?；视王；D(zhuǎn)移酶2（diacylglycerol acyltransferase 2,Dgat2）、脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein,Fabp）、硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase 1,Scd1）和肪酸合成酶（fatty acid synthase,Fas）的mRNA呈現(xiàn)日變化。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),生物鐘基因參與瘤胃上皮揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）代謝的調(diào)控,Clock、Bmal1、Per2 和Per3與單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1/4（monocarboxylate transporter 1/4,Mct1/4）存在顯著的相關(guān)性[52]。綜上可知,晝夜節(jié)律參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和吸收。

2.3 蛋白質(zhì)吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機(jī)制

生物鐘基因已被證明可以調(diào)節(jié)腸道肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的節(jié)律[53]。蛋白質(zhì)在消化道中被消化成氨基酸、二肽和三肽,其中,二肽和三肽由PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)。PEPT1是質(zhì)子依賴的肽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠?qū)+和肽轉(zhuǎn)運(yùn)到腸上皮細(xì)胞中,肽的轉(zhuǎn)運(yùn)與H+濃度相關(guān),而與細(xì)胞內(nèi)肽的濃度無關(guān)。為了能夠有效進(jìn)行肽的轉(zhuǎn)運(yùn),細(xì)胞內(nèi)的H+濃度被Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（Na+/H+exchanger 3,NHE3）維持在較低水平。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將H+泵入腸細(xì)胞,并交換出Na+,使細(xì)胞內(nèi)Na+濃度保持較低水平,同時(shí)K+-ATP酶泵出Na+,輸入K+。機(jī)體通過這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的共同作用促進(jìn)腸上皮細(xì)胞對(duì)肽的攝取。所有的肽在腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被水解為氨基酸,并通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨過基底外側(cè)轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中[54～55]。

大鼠結(jié)腸中Nhe3的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性[54]。研究報(bào)道,Cry1和Cry2敲除小鼠與Clock突變小鼠中Nhe3的mRNA表達(dá)均降低[54];Nhe3的啟動(dòng)子含有一個(gè)E-box序列,該序列可被CLOCK:BMAL1異二聚體反式激活,提示Nhe3的這種有節(jié)奏的表達(dá)可能是由結(jié)腸生物鐘驅(qū)動(dòng)的[5,54]。

PEPT1的表達(dá)在24 h內(nèi)也會(huì)發(fā)生節(jié)律性變化。Pan等[5]檢測(cè)了自由進(jìn)食糖基肌氨酸并保持12 h︰12 h光暗周期的大鼠小腸中PEPT1的每日節(jié)律,發(fā)現(xiàn)PEPT1的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平在20:00時(shí)最高,在08:00時(shí)最低。但是,Saito等[55]發(fā)現(xiàn),決定Pept1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子SP1和CDX2在24 h內(nèi)沒有表達(dá)變化;此外,調(diào)節(jié)Pept1的另一種轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα）的缺乏雖然會(huì)降低Pept1的基礎(chǔ)表達(dá)水平,但對(duì)其每日表達(dá)沒有顯著影響[56],這表明它們可能不參與Pept1的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)。Okamura等[56]發(fā)現(xiàn),Dbp（D site of albumin promoter binding protein）的mRNA水平的日常節(jié)律與Pept1的mRNA的節(jié)律相似。此外,該研究團(tuán)隊(duì)確定了Pept1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)域中的DBP結(jié)合位點(diǎn),并得出結(jié)論:DBP可能有助于Pept1表達(dá)的節(jié)律性變化。另外有研究發(fā)現(xiàn),小鼠胃蛋白酶原的分泌在24 h內(nèi)呈周期性變化,在休息期間達(dá)到高峰[57]。同樣,胰液的分泌在大鼠和豬中都有晝夜節(jié)律性[58～59]。

2.4 離子吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機(jī)制

結(jié)腸介導(dǎo)的電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[60]。結(jié)腸的主要功能是吸收水和電解質(zhì),Na+和Cl-的吸收主要反映了兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性,一種是Na+/H+交換器（NHE）,另一種是Cl-/HCO3-交換劑（anion exchanger protein,AE）。研究表明,Nhe3和Ae1的表達(dá)具有晝夜節(jié)律,此外,參與NaCl吸收的其他關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道蛋白也受生物鐘基因的調(diào)控,如大鼠結(jié)腸黏膜鈉鉀ATP酶蛋白A1（Atp1a1）、

上皮鈉離子通道蛋白γ（epithelial sodium channel gamma,γEnac）、下調(diào)式腺瘤載體（downregulated in adenoma,Dra）的mRNA表達(dá)均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律變化[61]。研究報(bào)道,血漿醛固酮和γEnac轉(zhuǎn)錄本之間的峰值水平具有相關(guān)性[61],這表明醛固酮可能在γEnac的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。此外,參與NaCl吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)可能直接受晝夜節(jié)律的控制,有研究發(fā)現(xiàn),CLOCK:BMAL1異二聚體調(diào)控Nhe3啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的E-box[54];小鼠中Cry1和Cry2的雙重敲除或Clock的突變均會(huì)使Nhe3的mRNA表達(dá)降低[54]?？偠灾?生物鐘參與腸道NaCl吸收,對(duì)腸道運(yùn)輸具有重要作用。

3 小結(jié)與展望

營(yíng)養(yǎng)素的吸收代謝與晝夜節(jié)律聯(lián)系密切,晝夜節(jié)律可調(diào)控消化道多種營(yíng)養(yǎng)素的吸收及其相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)（圖1）。從目前研究結(jié)果來看,生物鐘與消化道營(yíng)養(yǎng)代謝的互作調(diào)控機(jī)制沒有形成網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1）影響機(jī)體生物鐘節(jié)律的營(yíng)養(yǎng)水平、營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物及參與營(yíng)養(yǎng)吸收代謝的酶還需進(jìn)行探索;2）節(jié)律基因調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝相關(guān)因子的位點(diǎn)鑒定尚不能確定;3）生物鐘基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平上對(duì)消化道的調(diào)控機(jī)制還不清楚;4）不同動(dòng)物上的研究尚不系統(tǒng)。因此,未來應(yīng)從以上幾個(gè)方向著手進(jìn)行深入研究,以了解更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝過程中晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。

圖1 調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的生物鐘機(jī)制CLOCK:BMAL1異二聚體與啟動(dòng)子中的E-box元件結(jié)合激活Per和Cry基因的轉(zhuǎn)錄。PER蛋白和CRY蛋白形成復(fù)合物并抑制CLOCK:BMAL1異二聚體的活性,從而抑制其自身表達(dá)。CLOCK:BMAL1異二聚體也激活核受體REV-ERBα（reverse erythroblastosis virus α）和視黃素受體相關(guān)的孤兒受體 α （retinoid-related orphan nuclear receptor α,RORα）的轉(zhuǎn)錄,這些轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Bmal1和核因子白細(xì)胞介素3（nuclear factor interleukin 3,Nfil3）啟動(dòng)子中的RORE反應(yīng)元件（RORE激活BMAL1和NFIL3的表達(dá),而REV-ERBα抑制BMAL1和NFIL3的表達(dá)）。NFIL3和DBP共同調(diào)節(jié)D-box啟動(dòng)元件（NFIL3負(fù)向調(diào)節(jié),DBP正向調(diào)節(jié)）,這兩種因子協(xié)同D-box調(diào)控Per2基因的表達(dá),也調(diào)節(jié)時(shí)鐘控制基因（clock-controlled genes,CCGs）,使CCGs的表達(dá)具有晝夜節(jié)律。此外,CLOCK:BMAL1異二聚體還調(diào)節(jié)參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的CCGs的晝夜節(jié)律表達(dá)。例如:BMAL1與己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Sglt1、Glut2和Glut5的啟動(dòng)子結(jié)合,參與糖代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體有節(jié)奏地激活SHP,從而使SHP抑制Mtp的表達(dá),參與脂代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體與Noc轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的E-box結(jié)合,參與脂代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體反式激活Nhe3啟動(dòng)子中的E-box序列,調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝。Fig.1 The biological clock in nutrient metabolism regulationCLOCK:BMAL1 heterodimer combines with the E-box element in the promoter to activate the transcription of Per and Cry genes.PER and CRY proteins form complexes and inhibit the activity of the CLOCK:BMAL1 heterodimer,thus inhibiting its own expression.CLOCK:BMAL1 heterodimer also activate transcription of the reverse erythroblastosis virus α （REV-ERBα）and retinoid-related orphan nuclear receptor α （RORα）,which competitively bind the RORE response elements in the promoters of Bmal1 and nuclear factor interleukin 3（Nfil3）.RORE activates the expression of BMAL1 and NFIL3,while REV-ERBα inhibits their expression.NFIL3 and DBP adjust the D-box element（NFIL3 negative adjustment,DBP positive adjustment）.These two factors cooperate with D-box to regulate the expression of Per2 gene,and also regulate clock-controlled genes（CCGs）,so that CCGs have the circadian rhythm of expression.Furthermore,CLOCK:BMAL1 heterodimer also regulates the expression of circadian rhythm of CCGs involved in nutrient metabolism.Here are some examples:BMAL1 binds to the promoters of Sglt1,Glut2,and Glut5,participating in glucose metabolism;CLOCK:BMAL1 heterodimer activates SHP rhythmically,making SHP inhibit Mtp expression and participating in lipid metabolism;the heterodimer binds to the upstream E-box of Noc transcription start site,participating in lipid metabolism;the heterodimer transactivates the E-box sequence in the Nhe3 promoter,regulating protein metabolism.