劉貞 趙懷才 劉東岳 李秀昌 劉鵬飛

食管癌早期多無(wú)明顯癥狀，隨著疾病的進(jìn)展出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難[1]。有研究表明，對(duì)于食管癌T1a和T1b期病人內(nèi)窺鏡切除術(shù)是首選的治療方式[2]。一項(xiàng)薈萃分析顯示，接受食管癌切除術(shù)的病人，約半數(shù)病人在術(shù)后2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、疾病進(jìn)展[3]。Enane等[4]回顧性研究指出，不同分化程度食管癌術(shù)后預(yù)后存在差異；袁俊等[5]研究指出腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移與食管癌預(yù)后關(guān)系密切，認(rèn)為高腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是食管癌切除術(shù)術(shù)后獨(dú)立的良好預(yù)后因素。關(guān)于食管癌免疫逃逸機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分泌表達(dá)的誘導(dǎo)型共刺激因子(Inducible costimulator，ICOS)在維持免疫耐受中起重要作用，并參與了免疫逃逸和抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答過程[6]。關(guān)于胃癌預(yù)后的相關(guān)性因素分析指出，ICOS表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，靶向ICOS-L/ICOS共刺激軸可作為治療胃癌的潛在治療方法[7]。本研究探討基線ICOS表達(dá)水平與食管癌切除術(shù)病人短期預(yù)后的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2016年6月～2018年4月我院胸外科診斷及治療的食管癌病人139例，其中男性84例，女性55例；年齡40～70歲，平均年齡(55.96±9.86)歲；隨訪2年后，120例病人完成隨訪。120例病人中出現(xiàn)預(yù)后不良55例，作為預(yù)后不良組，未出現(xiàn)預(yù)后不良65例，作為預(yù)后良好組；以ICOS表達(dá)水平中位數(shù)為界值，分為ICOS低表達(dá)組(60例)和ICOS高表達(dá)組(60例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并通過術(shù)前病理檢測(cè)確診為食管癌[8]；(2)無(wú)肺，肝，腦，腎和腎上腺等轉(zhuǎn)移；(3)術(shù)前病理檢測(cè)為食管鱗狀細(xì)胞癌；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他器官或組織腫瘤；合并嚴(yán)重心肺功能疾病、營(yíng)養(yǎng)狀況差及呈惡液質(zhì)樣者；繼發(fā)性食管癌；瘤體已與主要器官，如主動(dòng)脈、氣管等緊密粘連而不能切除；依從性差，不配合隨訪。本研究經(jīng)我院倫理委員委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1.治療方法：參照2014年版中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)鏡學(xué)分會(huì)制訂的《中國(guó)早期食管癌篩查及內(nèi)鏡診治專家共識(shí)意見》的手術(shù)治療原則及方案進(jìn)行治療[9]。

2.基線ICOS表達(dá)水平檢測(cè)：利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋以5 μm切片，石蠟切片以二甲苯脫蠟，乙醇水化；完成后采用0.3%雙氧水孵育15分鐘，微波抗原修復(fù)15分鐘；冷卻至室溫后充分水洗，采用10%牛血清白蛋白封閉30分鐘；滴加經(jīng)PBS稀釋的ICOS抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜；使用通用型HRP生物標(biāo)記素標(biāo)記二抗孵育30分鐘；DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片鏡檢。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，<25%為1分，25～50%為2分，>75%為3分。細(xì)胞著色輕度：淡黃色為1分，棕黃色2分，棕褐色為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分×著色強(qiáng)度得分為最終評(píng)分，1～3分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

3.觀察指標(biāo)：收集兩組病人人口學(xué)資料，包括年齡、性別、BMI等；既往史，包括高血壓、手術(shù)史等；實(shí)驗(yàn)室及病理檢查資料，包括腫瘤TNM分期、腫瘤位置、大小、手術(shù)入路、手術(shù)方式、淋巴清掃情況等。

4.隨訪：兩組病人均門診隨訪2年，隨訪術(shù)后預(yù)后情況，隨訪截止時(shí)間2020年4月27日。參照世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST1.1)評(píng)定，分為4個(gè)等級(jí)[10]：進(jìn)展、穩(wěn)定、部分緩解、完全緩解。預(yù)后不良=進(jìn)展；預(yù)后良好=穩(wěn)定+部分緩解+完全緩解。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.隨訪結(jié)果：隨訪截止時(shí)間2020年4月27日，139例病人共計(jì)120例病人完成隨訪，失訪率為13.67%，最終納入120例食管癌病人，共計(jì)55例病人出現(xiàn)預(yù)后不良。見表1。

2.預(yù)后不良組與預(yù)后良好組病人臨床資料比較：預(yù)后不良組與預(yù)后良好組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、淋巴結(jié)清掃數(shù)目、基線ICOS表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組病人臨床資料比較

3.食管癌切除術(shù)病人短期預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素分析：Logistics多因素回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=0.132)、分化程度(OR=0.359)基線ICOS低表達(dá)(OR=0.303)是食管癌切除術(shù)術(shù)后病人預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。見表2。

表2 多因素Logistics分析

4.兩組病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)比較：K-M生存分析曲線顯示，基線ICOS高表達(dá)組病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)低于基線ICOS低表達(dá)組(log-rank χ2=7.934，P=0.005)。見圖1。

圖1 兩組食管癌切除術(shù)術(shù)后病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比較

5.基線ICOS表達(dá)水平預(yù)測(cè)病人預(yù)后不良的效能：基線ICOS 表達(dá)水平預(yù)測(cè)病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的AUC為0.726，特異度為72.73%、敏感度為67.69%，優(yōu)于分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見圖2，表3。

圖2 基線ICOS 表達(dá)水平預(yù)測(cè)食管癌切除術(shù)術(shù)后病人預(yù)后不良的ROC曲線

表3 基線ICOS表達(dá)水平預(yù)測(cè)食管癌切除術(shù)術(shù)后病人預(yù)后不良的效能

討論

食管癌是最常見的惡性腫瘤，5年總體存活(OS)<20%，每年導(dǎo)致超過40萬(wàn)人死亡[11]。食管癌切除術(shù)是治療食管癌的主要方式，然而食管癌切除術(shù)術(shù)后約50%病人出現(xiàn)預(yù)后不良，影響術(shù)后生存期[12]。術(shù)后病人預(yù)后分層在制定最佳治療方式中起著至關(guān)重要的作用。目前，用于預(yù)測(cè)食管癌切除術(shù)術(shù)后預(yù)后情況的因子眾多，包括腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。ICOS是一種由Tregs分泌的細(xì)胞因子。多項(xiàng)研究表明，ICOS與多種腫瘤疾病的疾病進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)[13-15]。盡管機(jī)制尚未完全了解，但關(guān)于胃癌、直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)高ICOS表達(dá)水平與病人良好預(yù)后呈正相關(guān)；Solinas等[16]研究證實(shí)，ICOS可抑制對(duì)宿主的有害免疫反應(yīng)，表明ICOS參與了腫瘤病人預(yù)后過程。本研究通過檢測(cè)食管癌病人基線ICOS表達(dá)水平，探討其與病人預(yù)后的相關(guān)性。

ICOS屬B7-CD28免疫球蛋白超家族，是在活化T細(xì)胞上表達(dá)的活化共刺激免疫檢查點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其配體ICOSL在抗原呈遞細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)[17]。ICOS和ICOSL的表達(dá)與激活免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的可溶性因子的釋放有關(guān)。ICOS和ICOSL的結(jié)合在T細(xì)胞亞群的多樣性中產(chǎn)生T細(xì)胞活化和效應(yīng)子功能，以及由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的抑制免疫活性，在增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答中具顯著作用。一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌研究發(fā)現(xiàn)，ICOS的高表達(dá)與結(jié)直腸癌病人的總生存期(OS)顯著相關(guān)(n=230，P<0.001)；多變量分析證明，ICOS表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后因素，證實(shí)ICOS參與了腫瘤的預(yù)后過程。在本研究中K-M曲線分析顯示，ICOS高表達(dá)組病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)低于ICOS低表達(dá)組(log-rank χ2=5.971)；多因素分析顯示，ICOS低表達(dá)水平為病人術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。ICOS主要在CD4+T細(xì)胞上表達(dá)，表達(dá)水平與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)增加和程序性死亡(PD-1)表達(dá)有關(guān)；介導(dǎo)了調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的關(guān)鍵雙向信號(hào)，促進(jìn)和維持T細(xì)胞反應(yīng)的正性第二信號(hào)和調(diào)節(jié)T細(xì)胞耐受性的負(fù)性第二信號(hào)。同時(shí)在調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞中起重要作用，可促進(jìn)腫瘤病人Th1效應(yīng)子反應(yīng)，通過腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和MDSCs在內(nèi)的腫瘤相關(guān)髓樣細(xì)胞通訊來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18-19]。ICOS與其配體ICOSL結(jié)合通過TAM或腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路中參與CD4+T細(xì)胞細(xì)胞功能，并可響應(yīng)在非造血細(xì)胞上的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。這可能有助于改善食管癌病人術(shù)后預(yù)后，降低預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化程度是食管癌病人術(shù)后預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因素。腫瘤細(xì)胞增殖的復(fù)雜過程是由主轉(zhuǎn)錄因子(TF)MYC協(xié)調(diào)，TF將祖細(xì)胞定型轉(zhuǎn)入譜系，與MYC共同驅(qū)動(dòng)指數(shù)增殖，向正向分化，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期退出。分化程度與自我復(fù)制涉及增殖與該前向分化的脫鉤。細(xì)胞凋亡p53(TP53)或其主要輔因子的主要調(diào)節(jié)劑可抑制癌癥細(xì)胞的無(wú)限增殖，但在低分化食管癌病人中該機(jī)制被普遍滅活，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移無(wú)顯著限制因素，同時(shí)，腫瘤內(nèi)形成的大量新生血管網(wǎng)為癌腫的增殖、遷移提供了生存條件，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌治療的重要預(yù)后因素和決定性因素，Kashima等[20]一項(xiàng)關(guān)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌10年生存率分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人預(yù)后不良比例明顯增高，表明發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響食管癌預(yù)后。

本研究通過繪制ROC曲線顯示，ICOS表達(dá)水平預(yù)測(cè)食管癌病人術(shù)后預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的AUC為0.726，特異度為72.73%、敏感度為67.69%，優(yōu)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度。說(shuō)明ICOS表達(dá)水平預(yù)測(cè)食管癌病人術(shù)后預(yù)后具顯著效能，能夠有效幫助臨床醫(yī)生識(shí)別食管癌病人術(shù)后預(yù)后不良人群。但限于本研究樣本量較少且僅納入食管鱗狀細(xì)胞癌病人，最終結(jié)果可能產(chǎn)生一定的偏倚，后期還需要增大樣本量，納入其他型食管癌病人來(lái)對(duì)本研究結(jié)論做進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、基線ICOS低表達(dá)是食管癌病人術(shù)后預(yù)后不良的危險(xiǎn)因數(shù)，其中ICOS低表達(dá)可作為預(yù)測(cè)食管癌病人術(shù)后預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。