楊彥平，許萌原，馬鳳嬌，郭文君,3，代 培，姜 敏，王銀平，劉 凱**

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 長(zhǎng)江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心， 江蘇 無(wú)錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

刀鱭(Coilianasus)是一種小型洄游性魚(yú)類，隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鱭屬(Coilia)，主要分布于中國(guó)沿海及長(zhǎng)江中下游地區(qū)[1]。刀鱭為典型的江海洄游性魚(yú)類，但其有多個(gè)生態(tài)型，除洄游型群體外，還有陸封型群體湖鱭(C.nasustaihuensis)和定居性群體短頜鱭(C.brachygnathus)[2]；洄游型刀鱭每年2月開(kāi)始在河口區(qū)陸續(xù)集群，然后溯河而上洄游；定居型刀鱭一般分布于長(zhǎng)江下游及附屬湖泊[3]。刀鱭肉質(zhì)鮮美，被列為“長(zhǎng)江三鮮”之首，深受廣大群眾喜愛(ài)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國(guó)長(zhǎng)江下游及河口區(qū)主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一[4-5]。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，水環(huán)境污染加劇，江湖聯(lián)系阻斷等導(dǎo)致刀鱭生存環(huán)境惡化，適宜繁殖場(chǎng)喪失，加之持續(xù)高強(qiáng)度捕撈導(dǎo)致其資源急劇衰退，種群結(jié)構(gòu)逐漸趨于低齡化和小型化[1，6-7]。鄭飛等[8]通過(guò)對(duì)1973～2009年不同時(shí)期的長(zhǎng)江刀鱭洄游群體的體長(zhǎng)、體重、年齡結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合比較，得出結(jié)論：長(zhǎng)江洄游型刀鱭群體無(wú)論是體長(zhǎng)、體重，還是年齡結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)年齡組，在總體上已呈現(xiàn)出逐漸變小的趨勢(shì)。張敏瑩等[9]統(tǒng)計(jì)的長(zhǎng)江下游刀鱭汛期捕撈量由1995年的1425.00 t銳減至2002年的285.52 t。各方面數(shù)據(jù)均顯示，長(zhǎng)江刀鱭資源被過(guò)度利用，種質(zhì)資源保護(hù)和種群恢復(fù)刻不容緩。種群遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎(chǔ)，也是物種進(jìn)化潛能的保證。針對(duì)重要物種開(kāi)展種群遺傳結(jié)構(gòu)研究、了解物種恢復(fù)潛力，有助于制定針對(duì)性的保護(hù)措施[5，10]。

目前，馬春艷等[4，11-13]分別用RAPD、AFLP、線粒體DNA D-loop全序列分子標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記等技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江刀鱭遺傳多樣性水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江刀鱭遺傳多樣性水平較為豐富。張媛等[14]利用同工酶、RAPD-PCR和ISSR-PCR等標(biāo)記技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江口刀鱭種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江口刀鱭個(gè)體之間遺傳變異水平較高，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的群體分化。

細(xì)胞色素b (Cytochrome b，Cytb)基因是一種線粒體蛋白質(zhì)編碼基因，約由1140個(gè)堿基組成，目前是mtDNA中唯一一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能被了解的較為清楚的蛋白編碼基因，該基因進(jìn)化速度適中而且容易使用通用引物擴(kuò)增和測(cè)序，其變異程度足以闡明種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，又有一定保守性，可進(jìn)行種上階元水平的研究，適用于一些親緣關(guān)系較近群體的遺傳結(jié)構(gòu)研究[15]，被認(rèn)為是了解種質(zhì)資源狀況和群體遺傳學(xué)的理想工具，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類分子系統(tǒng)學(xué)和遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、物種品系鑒定等方面的研究，尤其在近緣物種間的親緣關(guān)系研究中更為有效，也是魚(yú)類遺傳學(xué)研究中最為常用的目標(biāo)序列[15-18]。但基于Cytb基因序列研究長(zhǎng)江刀鱭種群遺傳結(jié)構(gòu)的報(bào)道并不多見(jiàn)[19]。本研究在長(zhǎng)江禁漁退捕的背景下，基于Cytb基因序列對(duì)長(zhǎng)江4個(gè)區(qū)段刀鱭群體進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，初步探索了禁漁對(duì)長(zhǎng)江刀鱭群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響，以期為長(zhǎng)江刀鱭種質(zhì)資源養(yǎng)護(hù)及后續(xù)管理提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019年4～6月在長(zhǎng)江下游安徽段安慶 (AQ，30°28′30″～30°29′23″ N，116°58′50″～116°59′56″ E)、銅陵-當(dāng)涂 (TD，31°0′5″～31°32′54″ N、117°46′23″～118°22′14″ E)、江蘇段南京-鎮(zhèn)江 (NZ，32°11′22″～32°14′39″ N，118°57′26″～119°40′42″ E)、長(zhǎng)江口崇明 (CM，31°31′08″～31°30′16″ N，121°29′50″～121°40′32″ E)4個(gè)調(diào)查區(qū)段(圖1)，使用流刺網(wǎng)和拋定刺網(wǎng)采集刀鱭樣本，每個(gè)區(qū)段均為雌雄各20尾。取樣本背鰭或胸鰭，固定于無(wú)水乙醇中，常溫保存?zhèn)溆谩２糠謽颖疽匝?xì)胞(-20 ℃保存)為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 基因組DNA的提取

DNA提取所用試劑盒：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0。提取過(guò)程主要包括組織裂解、分離蛋白、洗脫和DNA收集，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 DNA檢測(cè)

提取的DNA通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.4 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

PCR反應(yīng)體系：引物各2 μL、2×Taq Master Mix(內(nèi)含Taq、buffer、dNTPs等) 25 μL，以及模板DNA 2 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。擴(kuò)增mtDNA控制區(qū)序列的引物序列為L(zhǎng)14724 (5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′ )和H15915 (5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′ )[20]。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增所得的DNA進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后判斷擴(kuò)增DNA與NCBI中已有刀鱭物種是否同源：所得序列在NCBI進(jìn)行blast比對(duì)，query coverage值為100%，說(shuō)明擴(kuò)增所得序列能夠被已有刀鱭序列完全覆蓋；E值為0，表示隨機(jī)分配可能性為0，進(jìn)一步說(shuō)明序列基本上完全匹配；indentity值為99%，表示該物種與其相似度為99%。綜上，可確定擴(kuò)增所得序列是刀鱭的Cytb基因序列。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序所得線粒體Cytb基因序列經(jīng)clustal X軟件進(jìn)行編輯、排序和手動(dòng)校對(duì)。采用MEGA 3.1軟件計(jì)算序列堿基的組成、變異位點(diǎn)數(shù)、群體間和群體內(nèi)的遺傳距離，并采用鄰接法(Neighbour-joining method，NJ)構(gòu)建中間分化的系統(tǒng)樹(shù)。利用DnaSP 5.0軟件計(jì)算序列的單倍型數(shù)(H)、群體的單倍型多樣性 (Hd) 、群體核苷酸多樣性 (π)和平均核苷酸差異數(shù)(k)。應(yīng)用Arlequin 3.1軟件計(jì)算群體間遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)st)，并進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)和中性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 刀鱭群體遺傳多樣性

擴(kuò)增的160條刀鱭線粒體Cytb基因序列經(jīng)排序、校對(duì)和剪輯后，獲得160條長(zhǎng)度為790 bp的序列片段。在所有序列中，A、T、G和C 4種堿基平均含量分別為27.7%、31.3%、14.3%和26.7%，G的含量最低；變異位點(diǎn)34個(gè)，約占所測(cè)序列片段的4.3%。在160個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到31個(gè)單倍型(表1)，在所有單倍型中，7個(gè)單倍型為共享單倍型，其他24個(gè)單倍型為群體特有單倍型；共享單倍型中Hap2為所有群體共享，Hap4為銅陵-當(dāng)涂(TD)、南京-鎮(zhèn)江(NZ)、崇明(CM)區(qū)段3個(gè)群體共享；除Hap2和Hap4外，其他單倍型在群體中出現(xiàn)頻率較低，均不超過(guò)2次。應(yīng)用Arlequin 3.1軟件分析群體不變位點(diǎn)(ii)789個(gè)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)/顛換位點(diǎn)(R)的值為5.5。

表1 長(zhǎng)江刀鱭群體Cyt b序列單倍型分布特征

續(xù)表1：

160尾樣本分析顯示，單倍型多樣性指數(shù)為0.490±0.050，核苷酸多樣性指數(shù)為0.00078±0.00010(表2)。就單倍型結(jié)果而言，南京-鎮(zhèn)江(NZ)區(qū)段群體的單倍型多樣性指數(shù)較高，為0.547±0.096，崇明(CM)區(qū)段群體較低，為0.428±0.093；就序列而言，銅陵-當(dāng)涂(TD)區(qū)段群體的核苷酸多樣性指數(shù)最高，為0.00094±0.00025，崇明(CM)區(qū)段群體最低，為0.00066±0.00018。就性別而言(表3)，刀鱭雌性群體的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均高于雄性群體，雌性群體與雄性群體相比，單倍型多樣性高出近55%，核苷酸多樣性高出65%。

表2 長(zhǎng)江刀鱭群體的樣品信息和遺傳多樣性參數(shù)

表3 長(zhǎng)江刀鱭雌雄群體的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 刀鱭群體遺傳結(jié)構(gòu)

從長(zhǎng)江刀鱭4個(gè)地理群體的遺傳距離(表4)來(lái)看，群體內(nèi)的遺傳距離介于0.00060～0.00089，平均值為0.0007825；4個(gè)群體間的遺傳距離介于0.00070～0.00088，平均值為0.000785。此結(jié)果表明，長(zhǎng)江刀鱭群體間的遺傳距離與群體內(nèi)的遺傳距離非常接近，基本處于同一水平，無(wú)明顯遺傳分化。AMOVA結(jié)果顯示，長(zhǎng)江刀鱭群體內(nèi)遺傳變異為99.68%，群體間遺傳變異為0.32%(表5)，整體遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.00316，變異來(lái)源差異不顯著(P=0.20332)，說(shuō)明遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)。

表4 長(zhǎng)江刀鱭群體內(nèi)遺傳距離(對(duì)角線)及遺傳分化系數(shù)(Fst)(上對(duì)角線)和兩兩群體間遺傳距離(下對(duì)角線)

表5 基于Cyt b序列的長(zhǎng)江刀鱭群體變異組成分析

在用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中(圖2)，單倍型Hap1～Hap13、Hap15～Hap25、Hap27～Hap31(n=158)聚為一支，單倍型Hap14和Hap26(n=2)聚為另一支，單倍型Hap14是蕪湖的雄性個(gè)體，單倍型Hap26是安慶的雌性個(gè)體。

2.3 刀鱭群體歷史動(dòng)態(tài)

整體而言，Tijima’sD值和Fu’sFs值分別為-2.1543775和-8.6882225，均為負(fù)值且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均達(dá)顯著水平(P<0.05)(表6)。4個(gè)長(zhǎng)江刀鱭群體中性檢驗(yàn)Tijima’sD值介于-2.41066～-1.52331，平均為-0.53859，F(xiàn)u’sFs值介于-11.12077～-3.74634，平均為-2.17206，兩項(xiàng)指標(biāo)差異均顯著(P<0.05)。

表6 長(zhǎng)江刀鱭4個(gè)群體的中性檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 刀鱭群體遺傳多樣性及歷史動(dòng)態(tài)分析

遺傳多樣性亦稱為基因多樣性，從廣義上而言是指地球上生物所含遺傳信息總和。從狹義上而言，是指一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和[21]。物種遺傳多樣性的高低與物種的生存能力、適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力呈正相關(guān)，遺傳多樣性越高，物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，蘊(yùn)含著比較大的進(jìn)化潛力和豐富的育種及遺傳改良能力，也越容易擴(kuò)大其生存范圍；低水平的遺傳多樣性預(yù)示著適應(yīng)能力較弱，有害隱形基因表達(dá)增加及經(jīng)濟(jì)性狀衰退，最終導(dǎo)致物種退化。本研究獲得的基因序列中A+T的含量(59%)高于C+G的含量(41%)，堿基組成不均一，具有較大偏向性，這與張燕萍等[4]、唐文喬等[22]的研究結(jié)果一致。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的兩個(gè)重要指標(biāo)[23]。馬春艷等[24]通過(guò)Shannon多樣性指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)說(shuō)明刀鱭群體具有較高的遺傳多樣性水平。本研究中上述兩項(xiàng)指標(biāo)均高于2012年孫超[12]報(bào)道的日本刀鱭群體(Hd=0.400，π=0.000369)，低于2008年楊金權(quán)等[5]報(bào)道的長(zhǎng)江口刀鱭群體(Hd=0.9983，π=0.0262)，呈現(xiàn)相對(duì)較低的遺傳多樣性水平。根據(jù)Grant等[25]提出了單倍型多樣性和核苷酸多樣性高低分別以0.5和0.005為臨界值，將種群進(jìn)化模式分為了4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)伪缎投鄻有院秃塑账岫鄻有跃笥诘扔谂R界值、單倍型多樣性和核苷酸多樣性均小于臨界值、單倍型多樣性大于等于臨界值且核苷酸多樣性小于臨界值、單倍型多樣性小于臨界值且核苷酸多樣性大于等于臨界值，并針對(duì)4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的出現(xiàn)分別作出了種群歷史狀態(tài)解釋。本研究中的刀鱭群體單倍型多樣性接近臨界水平(0.49≈0.5)，核苷酸多樣性水平極低于臨界水平(0.00078<0.005)，核苷酸多樣性積累所需時(shí)間比單倍型所需時(shí)間長(zhǎng)[26]，說(shuō)明刀鱭可能是由一個(gè)較小的群體經(jīng)過(guò)歷史擴(kuò)張而來(lái)，擴(kuò)張后的進(jìn)化時(shí)間尚未達(dá)到累積核苷酸變異所需要的時(shí)間。根據(jù)Grant等[25]提出的種群進(jìn)化模式，可推測(cè)本研究中刀鱭群體曾經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)和種群擴(kuò)張。近年來(lái)的研究逐漸證實(shí)了這一點(diǎn)，加之人類活動(dòng)的擾動(dòng)，導(dǎo)致長(zhǎng)江刀鱭群體遺傳多樣性水平表現(xiàn)出下降趨勢(shì)[29]。

3.2 刀鱭群體遺傳分化程度分析

種群間的遺傳距離以及種群分化指數(shù)是衡量種群多態(tài)程度的一個(gè)重要指標(biāo)，值越大多態(tài)性程度就越高[28]。有研究表明，Cytb基因在種群間的基因遺傳距離一般水平范圍為0.005 - 0.015[23]，本研究中的結(jié)果也介于該范圍，這說(shuō)明長(zhǎng)江刀鱭群體間遺傳距離極小，群體間基因交流頻繁，主要是因?yàn)槠渖姝h(huán)境開(kāi)放，個(gè)體間信息交換不受水域限制。同時(shí)，AMOVA分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)江刀鱭群體間遺傳分化系數(shù)較小，群體內(nèi)遺傳變異較高(99.68%)，而群體間遺傳變異較低(0.32%)。該研究結(jié)果表明長(zhǎng)江刀鱭群體間的多態(tài)性較低，群體間的遺傳分化較小，遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)。推測(cè)開(kāi)放的水域特征與棲息環(huán)境有助于長(zhǎng)江刀鱭群體間遺傳信息的交流交換，是其遺傳分化較低的重要原因之一。

3.3 刀鱭群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及中性檢驗(yàn)分析

在單倍型NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，31種單倍型聚為2支，對(duì)應(yīng)單倍型顯示為Hap1～Hap13、Hap15～Hap25、Hap27～Hap31 (n=158)聚為一支，Hap14和Hap26聚為另一支，說(shuō)明長(zhǎng)江刀鱭群體中極少數(shù)個(gè)體可能發(fā)生了基因突變，也可能混雜著其他生態(tài)類型，但由于類似樣本量有限，因此，Hap14和Hap26對(duì)應(yīng)單倍型還有待于進(jìn)一步研究。楊金權(quán)等[29]曾通過(guò)中性檢驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)親緣關(guān)系分析得出長(zhǎng)江及其南部臨近水域的刀鱭群體約在更新世末期的0.17至0.13百萬(wàn)年前有過(guò)種群的擴(kuò)張歷史，并分析其可能是受到更新世末期海平面升降的影響。本研究中的中性檢驗(yàn)結(jié)果均為負(fù)值且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均達(dá)顯著水平，這說(shuō)明長(zhǎng)江刀鱭群體積累了較多的低頻突變，DNA進(jìn)化偏離了中性選擇[30]，指示長(zhǎng)江刀鱭群體歷史上可能發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張。本研究結(jié)果可進(jìn)一步佐證楊金權(quán)等[29]的觀點(diǎn)，同時(shí)也與本文中單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析后得出的結(jié)論一致。