王 龍，王 芳，湯 蕾，童盼盼，張亞若，王江波,3*

(1.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，新疆 阿拉爾843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團 塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

紅肉蘋果(MalusniedzwetzkyanaDieck)為薔薇科蘋果屬果樹，是我國珍貴樹種，該果樹開花早，結(jié)果早，豐產(chǎn)，抗逆性強，其花、葉、果實等器官富含花青苷，且?guī)в胁煌潭鹊募t色[1]。新疆紅肉蘋果是一種果肉、果皮及果核均為紅色且擁有多種生物活性物質(zhì)的獨特蘋果屬果實[2]。花青苷對果實顏色的形成有著重要的作用，花青苷是新疆紅肉蘋果中多酚的一種，屬黃酮類化合物[3]。

花青苷為蘋果體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，由葡萄糖代謝產(chǎn)生的苯丙氨酸為前體物質(zhì)，一步步在各種酶的催化下合成而來[4]?；ㄇ嘬盏暮铣墒艿浇Y(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控[5]，其中部分對花青苷合成起調(diào)控作用的基因表達(dá)受環(huán)境因子的影響，比如溫度、光照和營養(yǎng)狀況[6-7]。前人對花青苷合成協(xié)同作用的結(jié)構(gòu)基因的研究主要集中在與花青苷合成相關(guān)酶密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因ANS、UFGT、F3H、PYL、DFR、CHS和對結(jié)構(gòu)基因具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH、TTG1等上[8-11]。

目前，有關(guān)紅肉蘋果花青苷合成所涉及到的酶和調(diào)控因子已有部分研究，但對于花青苷含量及其與相關(guān)基因表達(dá)量之間的關(guān)系尚未明確，因此，本研究以新疆紅肉蘋果克孜阿爾瑪、夏紅肉及國外引進(jìn)紅肉品種紅色之愛為試材，測定了其果實在不同發(fā)育時期果皮花青苷含量及相關(guān)基因的表達(dá)量，旨在進(jìn)一步了解花青苷合成機制，為培育紅肉蘋果新品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選取輪臺南疆特色果樹資源圃的紅肉品種夏紅肉、克孜阿爾瑪，以及第一師阿拉爾市十二團從國外引進(jìn)的紅肉品種紅色之愛，在盛花后30、60、90、120、150 d(紅色之愛在盛花后30 d未采集樣品)在樹冠外圍中部的4個不同方向隨機選取無病蟲害、大小基本相同的10個果實，各3次重復(fù)，用泡沫冰盒帶回實驗室，將果皮快速切成細(xì)小塊狀，用液氮處理后分別裝入提前準(zhǔn)備好的實驗袋，放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 花青苷提取及含量測定 花青素提取方法為pH示差法，并根據(jù)實際情況稍作調(diào)整[12]。取出部分所需樣品，快速用液氮研磨充分后準(zhǔn)確稱取0.4 g，分別用2 mL的pH=1的緩沖液(含50 mmol/L KCl和150 mmol/L HCl)和pH=4.5的緩沖液(含400 mmol/L NaCH3CO2和240 mmol/L HCl)在低溫下抽提4 h，直至樣品基本呈白色；抽提完成后，在12000 r/min，4 ℃條件下離心15 min；取上清液測量其在510 nm的吸光度值(酶標(biāo)儀)?；ㄇ嗨貪舛扔嬎愎綖椋夯ㄇ嗨貪舛?μg/g FW)=(ApH 1-ApH 4.5)×1000×484.8/24825×6。在本研究中0.4 g鮮樣近似為0.4 mL體積。

1.2.2 引物設(shè)計 在NCBI上查詢花青苷合成相關(guān)的候選基因，并參考An[13]和孫曉紅[14]等報道的基因序列，設(shè)計花青苷合成相關(guān)基因的實時熒光定量PCR(quantitative Real Time PCR, qRT-PCR)引物。引物名稱及序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物

1.2.3 果皮RNA提取及qRT-PCR分析 按照上海生工SK8661柱式植物總RNA抽提純化試劑盒的說明書進(jìn)行樣品果皮RNA的提取，實驗步驟稍作變動[19]。用NanoDrop One核酸蛋白分析儀測定OD260、OD280，計算檢測RNA的純度和濃度。同時將提取的RNA樣品分別加入溴酚藍(lán)，混勻后用含有EB的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，在紫外投射儀上觀察RNA分子的大小、完整性、電泳譜帶的清晰度；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(cat.Z005163，Vazyme)合成cDNA，稀釋備用。

以Md-Actin作為qRT-PCR內(nèi)參基因，對蘋果花青苷合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行比較。定量PCR于美國ABI 型Q5熒光定量qPCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系按SYBR?Green PCR Master Mix(cat. #RR820A，TaKaRa)說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃保持30 s，95 ℃延伸15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，42個循環(huán)。在默認(rèn)條件下讀取CT值。計算2-△△CT值，進(jìn)行相對表達(dá)量分析，每個發(fā)育期樣品基因表達(dá)量為3種生物學(xué)重復(fù)的平均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗所得數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel進(jìn)行整理、統(tǒng)計、分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種蘋果品種果實在不同發(fā)育時期果皮的花青苷含量變化

在果實不同發(fā)育時期果皮花青苷含量變化結(jié)果如圖1，在花后150 d時的外觀表型見圖2。紅肉蘋果夏紅肉果皮花青苷含量在盛花后30 d達(dá)到最高，其含量為135.732 mg/g，隨后開始下降，在90 d時降至最低，然后持續(xù)上升，在盛花后150 d時其花青苷含量再次有明顯升高；克孜阿爾瑪果皮花青苷含量變化趨勢與夏紅肉相同；紅色之愛果皮花青苷含量在盛花后60 d達(dá)到最高，其含量為88.840 mg/g，而后持續(xù)降低，在120 d時達(dá)到最低，在150 d時有所回升。在盛花后30 d時，夏紅肉與克孜阿爾瑪花青苷含量存在顯著差異；盛花后60 d，紅色之愛與夏紅肉、克孜阿爾瑪?shù)幕ㄇ嘬蘸看嬖陲@著差異；盛花后90、120 d這3個品種之間互相存在顯著差異；盛花后150 d夏紅肉、紅色之愛與克孜阿爾瑪存在顯著性差異。

圖1 3種蘋果品種不同發(fā)育時期果皮花青苷含量

圖2 3種紅肉蘋果品種花后150 d時的外觀表型

2.2 3種蘋果品種果實不同發(fā)育時期果皮花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量分析

對3種蘋果不同發(fā)育時期果皮花青苷合成結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果(圖3)表明：在6個結(jié)構(gòu)基因中F3H在3種蘋果盛花后90 d和120 d的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他5個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量。結(jié)構(gòu)基因CHI在夏紅肉果實發(fā)育的后4個時期表達(dá)量都高于其他品種，其次是紅色之愛、克孜阿爾瑪。結(jié)構(gòu)基因CHS在各紅肉蘋果發(fā)育的各個時期表達(dá)量呈升高、降低再回升的趨勢，總體上，在盛花后60 d表達(dá)量達(dá)到最高，在盛花后120 d表達(dá)量最低。結(jié)構(gòu)基因UFGT、DFR、F3H在紅色之愛盛花后120 d的表達(dá)量都大幅度高于其他各品種，同時這3個基因在夏紅肉盛花后90 d的表達(dá)量都高于其他時期，其中結(jié)構(gòu)基因DFR在紅色之愛盛花后150 d表達(dá)量最高。結(jié)構(gòu)基因F3H在夏紅肉盛花后90 d表達(dá)量最高，約為紅色之愛、克孜阿爾瑪?shù)?～73倍。在6個結(jié)構(gòu)基因中除UFGT、DFR、CHS外，其他3個基因在紅肉蘋果克孜阿爾瑪果實發(fā)育的后3個時期的表達(dá)量都低于其他兩種紅肉蘋果。

圖3 3種蘋果品種果實不同發(fā)育時期果皮花青苷合成結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量

2.3 3種蘋果品種果實不同發(fā)育時期果皮花青苷生物合成轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量分析

對3種蘋果不同發(fā)育時期果皮花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果(圖4)表明，轉(zhuǎn)錄因子MYB10的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他轉(zhuǎn)錄因子。在各紅肉蘋果盛花后60 d與150 d轉(zhuǎn)錄因子bLHL3與TTG1的表達(dá)量整體低于其他3個時期，這兩種轉(zhuǎn)錄因子在紅色之愛盛花后120 d的表達(dá)量達(dá)到最高，大幅度高于其他品種和其它時期；紅色之愛盛花后90 d轉(zhuǎn)錄因子bHLH33的表達(dá)量達(dá)到最高且大幅度高于其他各品種。在克孜阿爾瑪與夏紅肉發(fā)育全部時期4種轉(zhuǎn)錄因子的變化趨勢都呈先降低再升高再降低的趨勢，在紅色之愛發(fā)育的各個時期呈先升高再降低的趨勢。

圖4 3種蘋果品種果實不同發(fā)育時期果皮花青苷合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

花青苷作為植物重要的色素之一，對果皮色澤影響重大[15]。夏紅肉果皮和克孜阿爾瑪?shù)墓ぴ谑⒒ê?0 d花青苷含量達(dá)到最高，其次是紅色之愛果皮在盛花后60 d花青苷含量達(dá)到最高；隨著果實的生長發(fā)育，各個品種的花青苷含量開始下降，下降至最低后持續(xù)上升，至150 d再次大幅度增高。孫曉紅[16]研究發(fā)現(xiàn)紅肉蘋果果實在盛花后30 d花青苷含量達(dá)到最高，隨著紅肉蘋果成熟度的增加果實中花青苷含量開始降低，但部分品種在120 d和150 d果實花青苷含量有所回升，這與本實驗結(jié)果基本一致。

花青苷在植物特定位置上的表達(dá)水平是由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因共同控制的，經(jīng)過試驗、數(shù)據(jù)等分析發(fā)現(xiàn)，新疆紅肉蘋果夏紅肉花青苷含量在盛花后150 d時有明顯升高，而結(jié)構(gòu)基因在克孜阿爾瑪、夏紅肉盛花后120 d與150 d時表達(dá)量有明顯升高。結(jié)構(gòu)基因除F3H外，其他基因UFGT、ANS、DFR、CHI、CHS的表達(dá)量在各個處理之間差異較小，結(jié)構(gòu)基因F3H在夏紅肉盛花后90 d的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他品種，在盛花后120 d在紅色之愛中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他品種。結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄因子MYB10在克孜阿爾瑪和紅色之愛盛花后120 d的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他品種。轉(zhuǎn)錄因子bHLH33在紅色之愛盛花后90 d的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他品種；bLHL3在紅色之愛盛花后120 d的表達(dá)量達(dá)到最高。因此，紅色之愛果皮花青苷含量與結(jié)構(gòu)基因F3H以及轉(zhuǎn)錄因子MYB10、bLHLH33的高水平表達(dá)有關(guān)，說明新疆紅肉蘋果花青苷的合成與其結(jié)構(gòu)基因F3H、CHI關(guān)系密切，而其調(diào)控可能是由轉(zhuǎn)錄因子MYB10起主導(dǎo)作用，轉(zhuǎn)錄因子bHLH33和TTG1為主要協(xié)助，bHLH3轉(zhuǎn)錄因子作為次要協(xié)助。然而宋楊等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)澤西越桔果皮中花青苷含量與CHS、F3H和UFGT的關(guān)系更為密切，在越桔花青苷合成過程中可能起更加重要的作用。而孫曉紅等[18]的研究結(jié)果認(rèn)為導(dǎo)致紅勛5號和新疆1號紅肉蘋果花青苷含量高的主要原因可能是具有R6R6啟動子基因型和高水平表達(dá)的ANS、UFGT基因及MYB10、TTG1、bHLH33轉(zhuǎn)錄因子。前人對花青苷的研究結(jié)果都存在著多多少少的差異，也正是這些差異說明果皮紅色性狀的調(diào)控機制非常復(fù)雜，具體機制的明確則需要更專業(yè)更深入的研究和實踐。

3.2 結(jié)論

本試驗研究結(jié)果表明：夏紅肉果皮和克孜阿爾瑪果皮中的花青苷含量變化趨勢相同，在盛花后30 d花青苷含量均達(dá)到最高，然后持續(xù)下降至最低，在盛花后150 d其含量再次有明顯升高；紅色之愛果皮花青苷含量在盛花后60 d達(dá)到最高；結(jié)構(gòu)基因F3H、CHI與轉(zhuǎn)錄因子MYB10、bLHLH33的高水平表達(dá)對花青苷合成有促進(jìn)作用。