王立新,張彤,劉秀嬋,王毅
(天津市天津醫(yī)院,天津 300211)
類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)炎、滑膜增生和骨質(zhì)破壞為特征的慢性自身免疫性疾病,受累滑膜組織中常有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤,其中T 細胞在RA 的發(fā)病中處于中心地位[1]。雷公藤是治療關(guān)節(jié)腫痛的傳統(tǒng)中藥,是治療RA 藥物中療效得到肯定的單味中藥。雷公藤及其提取物對RA 的調(diào)節(jié)機制主要涉及對T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞以及多種細胞因子表達的影響[2]。雷公藤甲素(TP)是從雷公藤中分離獲得的最主要的抗炎、免疫抑制活性成分[3]。研究顯示TP 可以降低T 細胞對多種細胞因子如白細胞介素(IL)-2、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-17 等的分泌,以及抑制T 細胞增殖分化從而緩解RA 炎癥反應(yīng)[4]。從Th1 相關(guān)的基因調(diào)控和趨化因子表達等方面考察TP 的作用機制還值得深入探索和研究。
T-bet 和GATA3 分別是Th1/Th2 細胞的轉(zhuǎn)錄因子[5],Th1 細胞分泌的IFN-γ 通過JAK1/JAK2 信號途徑激活、誘導(dǎo)T-bet 基因表達,而T-bet 又可以誘導(dǎo)Th1 分化繼續(xù)產(chǎn)生IFN-γ,形成正反饋環(huán)路。與T-bet 作用相反,GATA3 促進Th0 向Th2 細胞分化,這兩個基因參與Th1/Th2 細胞分化平衡[6]。此外,IFN-γ 誘導(dǎo)的趨化因子(CXCL)10 通過CXCL 受體3(CXCR3)介導(dǎo)活化T 細胞,尤其是Th1 細胞遷移[7-8]。在RA 患者的血清、滑液(SF)和滑膜組織(ST)中,CXCL10 表達水平升高,因此CXCL10 升高也成為宿主發(fā)生免疫反應(yīng),尤其是Th1 細胞主導(dǎo)的免疫反應(yīng)發(fā)生的標志[9]。與CXCL9 和CXCL11 相比,CXCL10與CXCR3 親和力更高,CXCL10 不僅對T 細胞的發(fā)育、遷移、黏附起著重要作用,還能活化單核細胞及自然殺傷細胞參與自身免疫疾病的發(fā)生過程[10]。以CXCL10/CXCR3 為靶標調(diào)節(jié)免疫細胞的活化和定位用于RA 治療的研究也取得一定進展[11]。
TP 對IFN-γ 表達具有明確的抑制作用,但TP 對RA 患者的免疫調(diào)節(jié)是否也會影響T-bet/GATA3 和CXCL10/CXCR3 的表達值得探索。本研究欲通過CD3 抗體誘導(dǎo)活化RA 患者T 細胞,在分析TP 對Th1、Th2 細胞分化及相關(guān)細胞因子分泌影響基礎(chǔ)上,進一步考察TP 對T-bet/GATA3 以及CXCL10/CXCR3表達的影響,旨在為TP 治療RA 的作用機制進行更深入的補充。
1.1 材料、主要試劑及儀器
1.1.1 臨床資料 本研究經(jīng)天津市天津醫(yī)院倫理委員會審核通過(2019 醫(yī)倫審103 號),所有研究對象均簽署知情同意書。選取2019 年11 月—2020 年1 月在天津市天津醫(yī)院感染風濕免疫科就診的21 例RA 患者作為研究對象,其中女性16 例,男性5 例。患者年齡為17~89 歲,平均年齡(56.15±17.66)歲,診斷參照美國風濕病學會(ACR)/歐洲抗風濕病聯(lián)盟(EULAR)2009 年RA 診斷標準。
1.1.2 試劑和儀器 GT-T551 無血清培養(yǎng)基購自Takara 公司,重組人IL-2(rhIL-2)購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司,TP 購自成都曼思特生物科技有限公司,人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司,CCK-8 試劑盒購自東仁化學科技(上海)有限公司,cDNA 合成試劑盒、微量樣本總RNA 提取試劑盒、熒光定量檢測試劑盒均購自天根生化科技有限公司。anti-human CD3 抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)anti-human CD4 抗體、PE antihuman IL-4、APC anti-human IFN-γ、PerCP-Cy5.5 anti-human CXCR3、細胞固定劑、破膜劑、1 000×布雷菲德菌素A(BFA)均購自Biolegend 公司。L929成纖維細胞由中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所提供,Luminex 細胞因子檢測試劑由國典醫(yī)藥提供,引物合成由上海生工提供。倒置顯微鏡型號為Olympus CKX41SF,流式細胞儀型號為美國BD Calibur,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀型號為美國伯樂CFX-96,Luminex 檢測儀器型號為Luminex 200,酶標儀型號為奧地利Tecan Sunrise。
1.2 實驗方法
1.2.1 考察TP 細胞毒性 本研究選取體外細胞毒性分析模型細胞L929 評價TP 的細胞毒性。取對數(shù)生長期的L929 細胞,以1×104個/mL 密度接種于96 孔板,實驗分為空白組(單純培養(yǎng)基)、對照組(TP濃度為0 nmol/L)、實驗組(TP 濃度分別為2.5、5、10、25 和50 nmol/L),每組5 個復(fù)孔,分別培養(yǎng)48、72 h。去掉培養(yǎng)上清,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞兩遍,每孔加入含有10%的CCK-8 新鮮培養(yǎng)基100 μL,37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵育2 h,采用酶標儀檢測450 nm 的吸光度(A)值。細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,其中As 為實驗孔(細胞+TP),Ac 為對照孔(細胞),Ab 為空白孔(單純培養(yǎng)基)。
1.2.2 TP 對RA 患者單個核細胞(PBMC)增殖活性的影響 收集10 mL 肝素抗凝全血,無菌條件下與PBS 緩沖液1∶1 混合,將細胞懸液緩慢轉(zhuǎn)移至等體積的淋巴細胞分離液上層,室溫條件下490×g 離心30 min。吸取中間白膜層單個核細胞,用10 倍體積PBS 洗滌(490×g,離心10 min)兩遍。用含1%雙抗、1 000 U rhIL-2 的GT-T551 培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL,每孔200μL 接種于CD3 單抗(0.5μg/mL)包被的96 孔板中,分為對照組(TP 濃度0 nmol/L)、實驗組(TP 濃度分別為2.5、5nmol/L),每組4 個復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h 后,用CCK-8檢測細胞增殖情況。
1.2.3 流式細胞儀檢測Th、Th1、Th2 細胞亞群變化和CXCR3 表達情況 取培養(yǎng)48 h 的PBMC 細胞,向培養(yǎng)孔內(nèi)加入終濃度為1×BFA,在37 ℃條件下孵育4 h,用于阻止細胞內(nèi)因子的釋放。離心收集細胞并用PBS 洗滌(350×g 離心5 min)兩遍。每組分別加入FITC anti-human CD4 和PerCP-Cy5.5 antihuman CXCR3 抗體各5 μL,室溫避光孵育20 min;1 mL PBS 洗滌兩遍后,加入0.5 mL 固定液室溫避光固定20 min;PBS 洗滌兩遍后加入1×破膜劑1 mL重懸細胞,350×g 離心5 min,重復(fù)2 次。最后分別加入5 μL 的PE anti-human IL-4 和APC anti-huma IFN-γ 抗體,室溫避光孵育20 min,PBS 洗滌后置于流式細胞儀檢測。
1.2.4 Luminex 檢測細胞因子表達水平 收集PBMC細胞培養(yǎng)上清,分別取50 μL 標準品和待測樣本,各加入50 μL 抗體標記微球,鋁箔紙封板,(800±50)r/min震蕩條件下室溫孵育2 h;洗板兩次,在所有孔中加入50 μL 的Biotin-檢測抗體,室溫條件下震蕩避光孵育1 h;洗板兩次,在所有孔中加PE-鏈霉親和素,50 μL/孔,室溫條件下震蕩避光孵育0.5 h。在所有孔中加100 μL 洗液,室溫震蕩2 min 使微球懸浮,在Luminex 200 儀器上檢測。
1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測基因表達變化 離心收集培養(yǎng)的PBMC 細胞沉淀,PBS 洗滌后按照試劑盒說明書提取樣本RNA;用反轉(zhuǎn)錄試劑盒37 ℃水浴60 min,將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 模板。引物序列檢索自Primerbank,使用Pubmed blast分析引物的特異性。具體序列見表1。檢測T-bet、GATA3、CXCL10 和CXCR3 基因的表達情況,內(nèi)參基因為GAPDH。每個樣本重復(fù)檢測3 次。
表1 T-bet、GATA3、CXCL10、CXCR3、GAPDH 引物序列Tab.1 Primer sequences of T-bet,GATA3,CXCL10,CXCR3,GAPDH
1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行處理,實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,多個實驗組與對照組之間的兩兩比較采用Dunnett 法,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 TP 細胞毒性考察 在TP 濃度<2.5nmol/L,培養(yǎng)48 h 條件下對L929 細胞存活率沒有影響(P>0.05),當濃度升高到50 nmol/L 時,細胞存活率為(90.93±2.56)%。隨著作用時間延長至72 h,TP 濃度在10 nmol/L 以上時,細胞存活率降低至90%以下,見圖1。以上結(jié)果表明濃度在25 nmol/L 以內(nèi),藥物作用時間為48 h 時TP 無顯著細胞毒性(P>0.05)。后續(xù)實驗在此培養(yǎng)時間及安全劑量范圍內(nèi)進行。
圖1 TP 對L929 細胞存活率的影響(±s,n=5)Fig.1 Effect of TP on L929 cell survival rate(±s,n=5)
2.2 TP 對RA 患者PBMC 增殖活性的影響 經(jīng)CD3抗體刺激培養(yǎng)48 h 后,細胞形成顯著增殖團,顯示出CD3 抗體可以有效刺激PBMC 細胞增殖,見圖2。經(jīng)CCK-8 檢測,TP 濃度為2.5 nmol/L 和5 nmol/L時,PBMC 細胞存活率受到顯著抑制(P<0.05),兩組細胞存活率分別為(82.7±27.57)%、(55.76±21.99)%,并且TP 對PBMC 細胞的增殖抑制作用具有顯著的劑量依賴性。見圖3。
圖2 倒置顯微鏡觀察PBMC 細胞增殖情況(×50)Fig.2 Inverted microscope observation of the cell proliferation of PBMC(×50)
圖3 不同實驗條件下PBMC 細胞存活率比較(±s,n=4)Fig.3 Comparison of survival rate of PBMC in different experimental condition(±s,n=4)
2.3 PBMC 中Th 細胞、Th1、Th2 細胞亞群比例變化 實驗組在TP 濃度為2.5 和5 nmol/L 時細胞亞群比例分別為(47.17±10.34)%和(44.91±11.89)%,均低于對照組Th 細胞亞群比例[(51.34±8.75)%],兩組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01 或P<0.001),且Th1 細胞亞群受抑制程度高于Th 細胞亞群,相反Th2 細胞亞群有升高趨勢,但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而Th1 與Th2比值在TP 調(diào)節(jié)下顯著降低(P<0.05 或P<0.001),見圖4。以上結(jié)果提示,TP 可以抑制Th、Th1 細胞增殖,降低Th1 與Th2 比值來調(diào)節(jié)Th1 和Th2 亞群比例,減少促炎細胞。本研究結(jié)果提示TP 可能會提高Th2 細胞亞群比例,進而抑制Th1 細胞的炎癥反應(yīng)發(fā)揮對RA 的免疫調(diào)節(jié)作用。
圖4 TP 對Th 細胞及Th1 和Th2 細胞亞群的影響(±s)Fig.4 Effect of TP on Th,Th1 and Th2 cell subpopulation(±s)
2.4 TP 對CXCR3 受體表達的影響 表達CXCR3受體的細胞亞群在TP 作用下比例顯著降低(P<0.05),且TP 對CXCR3+細胞亞群的抑制同樣具有劑量依賴性,見圖5。CXCR3通過與CXCL9、CXCL10、CXCL11等因子相互作用引導(dǎo)炎癥細胞向炎癥部位趨化,參與RA 疾病的發(fā)生、發(fā)展,因此抑制CXCR3 受體表達同樣可以減少免疫細胞向炎癥部位聚集。
圖5 TP 對CXCR3 受體表達的影響(±s)Fig.5 Effect of TP on the expression of CXCR3(±s)
2.5 TP 對PBMC 分泌因子表達的影響 本研究中除TNF-α 外,TP 對其余細胞因子的表達抑制作用均具有劑量依賴性,見圖6。在考察的細胞因子中不僅包括促炎因子,也包括抗炎因子。由此可見TP 對細胞因子表達的抑制作用是非特異性的,顯示出TP 具有很強的抑制細胞因子表達的作用。對于TNF-α,當TP 濃度為2.5 nmol/L 時可以顯著降低TNF-α 表達水平,隨著濃度升高為5 nmol/L 時,TNF-α 濃度與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在此濃度下,PBMC 細胞存活率顯著降低,因此TNF-α 表達沒有變化可能是TP 對免疫細胞活性抑制所致。隨著TP濃度升高,在表現(xiàn)出抑制作用的同時,也會對免疫細胞產(chǎn)生一定毒性。
圖6 TP 對細胞因子表達的影響(±s)Fig.6 Effect of TP on the expression of cytokines(±s)
2.6 TP 對T-bet/GATA3 及CXCL10/CXCR3 基因表達的影響 與對照組比較,兩個濃度的TP 對Tbet 和GATA3 基因表達及T-bet/GATA3 比值均無影響(P>0.05),所以在本研究中并未觀察到TP 對這兩種基因表達的調(diào)節(jié)作用。
CXCL10 的基因相對表達量在TP 濃度為5nmol/L時受到了抑制(P<0.05),見圖7,這與其蛋白表達水平變化趨勢一致,并且CXCL10 蛋白表達受IFN-γ誘導(dǎo),在TP 作用下IFN-γ 表達顯著下降,也可能是誘導(dǎo)CXCL10 表達降低的原因之一。
圖7 TP 對CXCR3 和CXCL10 基因表達的影響(±s)Fig.7 Effect of TP on the expression of CXCR3,CXCL10(±s)
RA 是一種以滑膜炎癥為主的慢性自身免疫性疾病。中藥雷公藤具有活血化瘀、去濕止痛的作用,是治療關(guān)節(jié)腫痛的傳統(tǒng)藥物,TP 是其最主要的抗炎與免疫抑制活性成分[12]。本研究通過體外實驗,從細胞、細胞因子和基因水平分別考察了TP 對RA 患者PBMC 的調(diào)節(jié)作用。低濃度TP 對L929 細胞沒有毒性,但對活化的PBMC 細胞增殖具有劑量依賴的抑制作用,這與之前報道TP 治療窗口窄、毒性大相一致[13]。
Th1 和Th2 免疫反應(yīng)失衡是RA 發(fā)病的重要原因[14]。分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ 等促炎細胞因子的效應(yīng)細胞Th1 在TP 作用下百分比降低,然而Th2細胞沒有受到顯著調(diào)節(jié),因此并未觀察到TP 抑制Th1 同時會促進Th2 細胞的特異性調(diào)節(jié)作用。這種現(xiàn)象可能與藥物劑量、作用時間以及免疫微環(huán)境中細胞因子、趨化因子等的影響相關(guān),有待進一步研究。Th1/Th2 比值顯著降低,表明TP 可以減少PBMC中效應(yīng)細胞比例從而緩解RA 中的炎癥反應(yīng)。
TNF-α 和IL-6 被認為是RA 滑膜細胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐[15],TNF-α 不僅會誘導(dǎo)Th1 型細胞因子的大量產(chǎn)生,使Th1/Th2 細胞的比例進一步失調(diào),也能誘發(fā)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和軟骨的破壞,參與滑膜炎癥反應(yīng)[16]?,F(xiàn)有研究報道靶向TNF-α 和IL-6 的中和抗體可以有效抑制滑膜炎癥反應(yīng)[17],因此對TNF-α和IL-6 表達的抑制也是TP 參與RA 免疫調(diào)節(jié)的重要機制。具有免疫調(diào)節(jié)作用的IL-4 可以誘導(dǎo)巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化,促進IL-10 分泌,并可以將細胞毒T 細胞(CTL)轉(zhuǎn)化為分泌IL-4 的無細胞毒性細胞,抑制IFN-γ 的表達[18]。盡管IL-4 和IL-10 作為抗炎因子可以協(xié)同抑制Th1 細胞分化,減少相關(guān)炎癥因子的分泌及炎性細胞浸潤[15],但本研究中這兩種細胞因子在TP 作用下表達水平同時降低,可能是因為TP 使具有調(diào)節(jié)作用的如Th2、Treg 等免疫細胞活性受到抑制所致。
CXCR3 與CXCL10 主要參與調(diào)節(jié)T 細胞、NK 細胞和巨噬細胞的遷移、分化與激活。CXCR3 是體內(nèi)分泌IFN-γ 的Th1 細胞所必需的[19]。抗CXCR3 抗體AMG487 可以降低RA CIA 小鼠體內(nèi)Th1、Th17以及Th22 細胞百分比并提高Treg 細胞比例[20]。CXCL10 可與表達在T 細胞表面的CXCR3 受體結(jié)合促進其活化并向Th1 細胞方向分化,在炎癥細胞向滑膜組織遷移及活化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[21]。Lee 等[7]研究強調(diào)了CXCL10 在RA 發(fā)病機制中的重要性,并提供了先前尚未確定的CXCL10 促進關(guān)節(jié)炎發(fā)展機制的細節(jié)。因此TP 對CXCL10 和CXCR3 表達的抑制,可以進一步緩解Th1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),也豐富了其對RA 免疫調(diào)節(jié)的作用機制。
與Th1 和Th2 細胞分化相關(guān)的T-bet 和GATA3基因[22]表達沒有顯著變化,一方面可能是經(jīng)TP 抑制后表達該基因的細胞活性降低,或者由于這兩種基因具有復(fù)雜多樣的生物學功能,如T-bet 不僅是Th1 型免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、樹突狀細胞、NK 細胞效應(yīng)細胞的建立和維持中也發(fā)揮著極其重要的作用[23]。而GATA3 基因也會調(diào)控Treg 細胞的分化[24],因此在TP 作用下并未體現(xiàn)出明顯變化。
本研究顯示TP 對RA 具有顯著且廣泛的非特異性免疫抑制作用。與體外培養(yǎng)細胞系不同,實驗中各組樣本間統(tǒng)計數(shù)據(jù)相對離散,正如李彥等[25]對雷公藤肝毒性的評價所述,造成這種現(xiàn)象的原因與每個個體免疫狀態(tài)、對藥物的敏感性以及基因表達差異有關(guān)。因此TP 作為臨床用藥還需進一步提高其靶向性,降低毒副作用,如何用于RA 臨床治療還有很大研究空間。