王立新，張彤，劉秀嬋，王毅

（天津市天津醫(yī)院，天津 300211）

類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)炎、滑膜增生和骨質(zhì)破壞為特征的慢性自身免疫性疾病，受累滑膜組織中常有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，其中T 細胞在RA 的發(fā)病中處于中心地位[1]。雷公藤是治療關(guān)節(jié)腫痛的傳統(tǒng)中藥，是治療RA 藥物中療效得到肯定的單味中藥。雷公藤及其提取物對RA 的調(diào)節(jié)機制主要涉及對T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞以及多種細胞因子表達的影響[2]。雷公藤甲素（TP）是從雷公藤中分離獲得的最主要的抗炎、免疫抑制活性成分[3]。研究顯示TP 可以降低T 細胞對多種細胞因子如白細胞介素（IL）-2、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-4、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-17 等的分泌，以及抑制T 細胞增殖分化從而緩解RA 炎癥反應(yīng)[4]。從Th1 相關(guān)的基因調(diào)控和趨化因子表達等方面考察TP 的作用機制還值得深入探索和研究。

T-bet 和GATA3 分別是Th1/Th2 細胞的轉(zhuǎn)錄因子[5]，Th1 細胞分泌的IFN-γ 通過JAK1/JAK2 信號途徑激活、誘導(dǎo)T-bet 基因表達，而T-bet 又可以誘導(dǎo)Th1 分化繼續(xù)產(chǎn)生IFN-γ，形成正反饋環(huán)路。與T-bet 作用相反，GATA3 促進Th0 向Th2 細胞分化，這兩個基因參與Th1/Th2 細胞分化平衡[6]。此外，IFN-γ 誘導(dǎo)的趨化因子（CXCL）10 通過CXCL 受體3（CXCR3）介導(dǎo)活化T 細胞，尤其是Th1 細胞遷移[7-8]。在RA 患者的血清、滑液（SF）和滑膜組織（ST）中，CXCL10 表達水平升高，因此CXCL10 升高也成為宿主發(fā)生免疫反應(yīng)，尤其是Th1 細胞主導(dǎo)的免疫反應(yīng)發(fā)生的標志[9]。與CXCL9 和CXCL11 相比，CXCL10與CXCR3 親和力更高，CXCL10 不僅對T 細胞的發(fā)育、遷移、黏附起著重要作用，還能活化單核細胞及自然殺傷細胞參與自身免疫疾病的發(fā)生過程[10]。以CXCL10/CXCR3 為靶標調(diào)節(jié)免疫細胞的活化和定位用于RA 治療的研究也取得一定進展[11]。

TP 對IFN-γ 表達具有明確的抑制作用，但TP 對RA 患者的免疫調(diào)節(jié)是否也會影響T-bet/GATA3 和CXCL10/CXCR3 的表達值得探索。本研究欲通過CD3 抗體誘導(dǎo)活化RA 患者T 細胞，在分析TP 對Th1、Th2 細胞分化及相關(guān)細胞因子分泌影響基礎(chǔ)上，進一步考察TP 對T-bet/GATA3 以及CXCL10/CXCR3表達的影響，旨在為TP 治療RA 的作用機制進行更深入的補充。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

1.1.1 臨床資料 本研究經(jīng)天津市天津醫(yī)院倫理委員會審核通過（2019 醫(yī)倫審103 號），所有研究對象均簽署知情同意書。選取2019 年11 月—2020 年1 月在天津市天津醫(yī)院感染風濕免疫科就診的21 例RA 患者作為研究對象，其中女性16 例，男性5 例。患者年齡為17～89 歲，平均年齡（56.15±17.66）歲，診斷參照美國風濕病學會（ACR）/歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）2009 年RA 診斷標準。

1.1.2 試劑和儀器 GT-T551 無血清培養(yǎng)基購自Takara 公司，重組人IL-2（rhIL-2）購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，TP 購自成都曼思特生物科技有限公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司，CCK-8 試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司，cDNA 合成試劑盒、微量樣本總RNA 提取試劑盒、熒光定量檢測試劑盒均購自天根生化科技有限公司。anti-human CD3 抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）anti-human CD4 抗體、PE antihuman IL-4、APC anti-human IFN-γ、PerCP-Cy5.5 anti-human CXCR3、細胞固定劑、破膜劑、1 000×布雷菲德菌素A（BFA）均購自Biolegend 公司。L929成纖維細胞由中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所提供，Luminex 細胞因子檢測試劑由國典醫(yī)藥提供，引物合成由上海生工提供。倒置顯微鏡型號為Olympus CKX41SF，流式細胞儀型號為美國BD Calibur，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增儀型號為美國伯樂CFX-96，Luminex 檢測儀器型號為Luminex 200，酶標儀型號為奧地利Tecan Sunrise。

1.2 實驗方法

1.2.1 考察TP 細胞毒性 本研究選取體外細胞毒性分析模型細胞L929 評價TP 的細胞毒性。取對數(shù)生長期的L929 細胞，以1×104個/mL 密度接種于96 孔板，實驗分為空白組（單純培養(yǎng)基）、對照組（TP濃度為0 nmol/L）、實驗組（TP 濃度分別為2.5、5、10、25 和50 nmol/L），每組5 個復(fù)孔，分別培養(yǎng)48、72 h。去掉培養(yǎng)上清，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞兩遍，每孔加入含有10%的CCK-8 新鮮培養(yǎng)基100 μL，37 ℃、5%二氧化碳（CO2）孵育2 h，采用酶標儀檢測450 nm 的吸光度（A）值。細胞存活率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，其中As 為實驗孔（細胞+TP），Ac 為對照孔（細胞），Ab 為空白孔（單純培養(yǎng)基）。

1.2.2 TP 對RA 患者單個核細胞（PBMC）增殖活性的影響 收集10 mL 肝素抗凝全血，無菌條件下與PBS 緩沖液1∶1 混合，將細胞懸液緩慢轉(zhuǎn)移至等體積的淋巴細胞分離液上層，室溫條件下490×g 離心30 min。吸取中間白膜層單個核細胞，用10 倍體積PBS 洗滌（490×g，離心10 min）兩遍。用含1%雙抗、1 000 U rhIL-2 的GT-T551 培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，每孔200μL 接種于CD3 單抗（0.5μg/mL）包被的96 孔板中，分為對照組（TP 濃度0 nmol/L）、實驗組（TP 濃度分別為2.5、5nmol/L），每組4 個復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h 后，用CCK-8檢測細胞增殖情況。

1.2.3 流式細胞儀檢測Th、Th1、Th2 細胞亞群變化和CXCR3 表達情況 取培養(yǎng)48 h 的PBMC 細胞，向培養(yǎng)孔內(nèi)加入終濃度為1×BFA，在37 ℃條件下孵育4 h，用于阻止細胞內(nèi)因子的釋放。離心收集細胞并用PBS 洗滌（350×g 離心5 min）兩遍。每組分別加入FITC anti-human CD4 和PerCP-Cy5.5 antihuman CXCR3 抗體各5 μL，室溫避光孵育20 min；1 mL PBS 洗滌兩遍后，加入0.5 mL 固定液室溫避光固定20 min；PBS 洗滌兩遍后加入1×破膜劑1 mL重懸細胞，350×g 離心5 min，重復(fù)2 次。最后分別加入5 μL 的PE anti-human IL-4 和APC anti-huma IFN-γ 抗體，室溫避光孵育20 min，PBS 洗滌后置于流式細胞儀檢測。

1.2.4 Luminex 檢測細胞因子表達水平 收集PBMC細胞培養(yǎng)上清，分別取50 μL 標準品和待測樣本，各加入50 μL 抗體標記微球，鋁箔紙封板，（800±50）r/min震蕩條件下室溫孵育2 h；洗板兩次，在所有孔中加入50 μL 的Biotin-檢測抗體，室溫條件下震蕩避光孵育1 h；洗板兩次，在所有孔中加PE-鏈霉親和素，50 μL/孔，室溫條件下震蕩避光孵育0.5 h。在所有孔中加100 μL 洗液，室溫震蕩2 min 使微球懸浮，在Luminex 200 儀器上檢測。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測基因表達變化 離心收集培養(yǎng)的PBMC 細胞沉淀，PBS 洗滌后按照試劑盒說明書提取樣本RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒37 ℃水浴60 min，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 模板。引物序列檢索自Primerbank，使用Pubmed blast分析引物的特異性。具體序列見表1。檢測T-bet、GATA3、CXCL10 和CXCR3 基因的表達情況，內(nèi)參基因為GAPDH。每個樣本重復(fù)檢測3 次。

表1 T-bet、GATA3、CXCL10、CXCR3、GAPDH 引物序列Tab.1 Primer sequences of T-bet，GATA3，CXCL10，CXCR3，GAPDH

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多個實驗組與對照組之間的兩兩比較采用Dunnett 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TP 細胞毒性考察 在TP 濃度<2.5nmol/L，培養(yǎng)48 h 條件下對L929 細胞存活率沒有影響（P＞0.05），當濃度升高到50 nmol/L 時，細胞存活率為（90.93±2.56）%。隨著作用時間延長至72 h，TP 濃度在10 nmol/L 以上時，細胞存活率降低至90%以下，見圖1。以上結(jié)果表明濃度在25 nmol/L 以內(nèi)，藥物作用時間為48 h 時TP 無顯著細胞毒性（P＞0.05）。后續(xù)實驗在此培養(yǎng)時間及安全劑量范圍內(nèi)進行。

圖1 TP 對L929 細胞存活率的影響（±s，n=5）Fig.1 Effect of TP on L929 cell survival rate（±s，n=5）

2.2 TP 對RA 患者PBMC 增殖活性的影響 經(jīng)CD3抗體刺激培養(yǎng)48 h 后，細胞形成顯著增殖團，顯示出CD3 抗體可以有效刺激PBMC 細胞增殖，見圖2。經(jīng)CCK-8 檢測，TP 濃度為2.5 nmol/L 和5 nmol/L時，PBMC 細胞存活率受到顯著抑制（P＜0.05），兩組細胞存活率分別為（82.7±27.57）%、（55.76±21.99）%，并且TP 對PBMC 細胞的增殖抑制作用具有顯著的劑量依賴性。見圖3。

圖2 倒置顯微鏡觀察PBMC 細胞增殖情況（×50）Fig.2 Inverted microscope observation of the cell proliferation of PBMC（×50）

圖3 不同實驗條件下PBMC 細胞存活率比較（±s，n=4）Fig.3 Comparison of survival rate of PBMC in different experimental condition（±s，n=4）

2.3 PBMC 中Th 細胞、Th1、Th2 細胞亞群比例變化 實驗組在TP 濃度為2.5 和5 nmol/L 時細胞亞群比例分別為（47.17±10.34）%和（44.91±11.89）%，均低于對照組Th 細胞亞群比例[（51.34±8.75）%]，兩組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 或P<0.001），且Th1 細胞亞群受抑制程度高于Th 細胞亞群，相反Th2 細胞亞群有升高趨勢，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而Th1 與Th2比值在TP 調(diào)節(jié)下顯著降低（P＜0.05 或P<0.001），見圖4。以上結(jié)果提示，TP 可以抑制Th、Th1 細胞增殖，降低Th1 與Th2 比值來調(diào)節(jié)Th1 和Th2 亞群比例，減少促炎細胞。本研究結(jié)果提示TP 可能會提高Th2 細胞亞群比例，進而抑制Th1 細胞的炎癥反應(yīng)發(fā)揮對RA 的免疫調(diào)節(jié)作用。

圖4 TP 對Th 細胞及Th1 和Th2 細胞亞群的影響（±s）Fig.4 Effect of TP on Th，Th1 and Th2 cell subpopulation（±s）

2.4 TP 對CXCR3 受體表達的影響 表達CXCR3受體的細胞亞群在TP 作用下比例顯著降低（P<0.05），且TP 對CXCR3+細胞亞群的抑制同樣具有劑量依賴性，見圖5。CXCR3通過與CXCL9、CXCL10、CXCL11等因子相互作用引導(dǎo)炎癥細胞向炎癥部位趨化，參與RA 疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此抑制CXCR3 受體表達同樣可以減少免疫細胞向炎癥部位聚集。

圖5 TP 對CXCR3 受體表達的影響（±s）Fig.5 Effect of TP on the expression of CXCR3（±s）

2.5 TP 對PBMC 分泌因子表達的影響 本研究中除TNF-α 外，TP 對其余細胞因子的表達抑制作用均具有劑量依賴性，見圖6。在考察的細胞因子中不僅包括促炎因子，也包括抗炎因子。由此可見TP 對細胞因子表達的抑制作用是非特異性的，顯示出TP 具有很強的抑制細胞因子表達的作用。對于TNF-α，當TP 濃度為2.5 nmol/L 時可以顯著降低TNF-α 表達水平，隨著濃度升高為5 nmol/L 時，TNF-α 濃度與對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。在此濃度下，PBMC 細胞存活率顯著降低，因此TNF-α 表達沒有變化可能是TP 對免疫細胞活性抑制所致。隨著TP濃度升高，在表現(xiàn)出抑制作用的同時，也會對免疫細胞產(chǎn)生一定毒性。

圖6 TP 對細胞因子表達的影響（±s）Fig.6 Effect of TP on the expression of cytokines（±s）

2.6 TP 對T-bet/GATA3 及CXCL10/CXCR3 基因表達的影響 與對照組比較，兩個濃度的TP 對Tbet 和GATA3 基因表達及T-bet/GATA3 比值均無影響（P>0.05），所以在本研究中并未觀察到TP 對這兩種基因表達的調(diào)節(jié)作用。

CXCL10 的基因相對表達量在TP 濃度為5nmol/L時受到了抑制（P<0.05），見圖7，這與其蛋白表達水平變化趨勢一致，并且CXCL10 蛋白表達受IFN-γ誘導(dǎo)，在TP 作用下IFN-γ 表達顯著下降，也可能是誘導(dǎo)CXCL10 表達降低的原因之一。

圖7 TP 對CXCR3 和CXCL10 基因表達的影響（±s）Fig.7 Effect of TP on the expression of CXCR3，CXCL10（±s）

3 討論

RA 是一種以滑膜炎癥為主的慢性自身免疫性疾病。中藥雷公藤具有活血化瘀、去濕止痛的作用，是治療關(guān)節(jié)腫痛的傳統(tǒng)藥物，TP 是其最主要的抗炎與免疫抑制活性成分[12]。本研究通過體外實驗，從細胞、細胞因子和基因水平分別考察了TP 對RA 患者PBMC 的調(diào)節(jié)作用。低濃度TP 對L929 細胞沒有毒性，但對活化的PBMC 細胞增殖具有劑量依賴的抑制作用，這與之前報道TP 治療窗口窄、毒性大相一致[13]。

Th1 和Th2 免疫反應(yīng)失衡是RA 發(fā)病的重要原因[14]。分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ 等促炎細胞因子的效應(yīng)細胞Th1 在TP 作用下百分比降低，然而Th2細胞沒有受到顯著調(diào)節(jié)，因此并未觀察到TP 抑制Th1 同時會促進Th2 細胞的特異性調(diào)節(jié)作用。這種現(xiàn)象可能與藥物劑量、作用時間以及免疫微環(huán)境中細胞因子、趨化因子等的影響相關(guān)，有待進一步研究。Th1/Th2 比值顯著降低，表明TP 可以減少PBMC中效應(yīng)細胞比例從而緩解RA 中的炎癥反應(yīng)。

TNF-α 和IL-6 被認為是RA 滑膜細胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐[15]，TNF-α 不僅會誘導(dǎo)Th1 型細胞因子的大量產(chǎn)生，使Th1/Th2 細胞的比例進一步失調(diào)，也能誘發(fā)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和軟骨的破壞，參與滑膜炎癥反應(yīng)[16]?，F(xiàn)有研究報道靶向TNF-α 和IL-6 的中和抗體可以有效抑制滑膜炎癥反應(yīng)[17]，因此對TNF-α和IL-6 表達的抑制也是TP 參與RA 免疫調(diào)節(jié)的重要機制。具有免疫調(diào)節(jié)作用的IL-4 可以誘導(dǎo)巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化，促進IL-10 分泌，并可以將細胞毒T 細胞（CTL）轉(zhuǎn)化為分泌IL-4 的無細胞毒性細胞，抑制IFN-γ 的表達[18]。盡管IL-4 和IL-10 作為抗炎因子可以協(xié)同抑制Th1 細胞分化，減少相關(guān)炎癥因子的分泌及炎性細胞浸潤[15]，但本研究中這兩種細胞因子在TP 作用下表達水平同時降低，可能是因為TP 使具有調(diào)節(jié)作用的如Th2、Treg 等免疫細胞活性受到抑制所致。

CXCR3 與CXCL10 主要參與調(diào)節(jié)T 細胞、NK 細胞和巨噬細胞的遷移、分化與激活。CXCR3 是體內(nèi)分泌IFN-γ 的Th1 細胞所必需的[19]。抗CXCR3 抗體AMG487 可以降低RA CIA 小鼠體內(nèi)Th1、Th17以及Th22 細胞百分比并提高Treg 細胞比例[20]。CXCL10 可與表達在T 細胞表面的CXCR3 受體結(jié)合促進其活化并向Th1 細胞方向分化，在炎癥細胞向滑膜組織遷移及活化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[21]。Lee 等[7]研究強調(diào)了CXCL10 在RA 發(fā)病機制中的重要性，并提供了先前尚未確定的CXCL10 促進關(guān)節(jié)炎發(fā)展機制的細節(jié)。因此TP 對CXCL10 和CXCR3 表達的抑制，可以進一步緩解Th1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，也豐富了其對RA 免疫調(diào)節(jié)的作用機制。

與Th1 和Th2 細胞分化相關(guān)的T-bet 和GATA3基因[22]表達沒有顯著變化，一方面可能是經(jīng)TP 抑制后表達該基因的細胞活性降低，或者由于這兩種基因具有復(fù)雜多樣的生物學功能，如T-bet 不僅是Th1 型免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、樹突狀細胞、NK 細胞效應(yīng)細胞的建立和維持中也發(fā)揮著極其重要的作用[23]。而GATA3 基因也會調(diào)控Treg 細胞的分化[24]，因此在TP 作用下并未體現(xiàn)出明顯變化。

本研究顯示TP 對RA 具有顯著且廣泛的非特異性免疫抑制作用。與體外培養(yǎng)細胞系不同，實驗中各組樣本間統(tǒng)計數(shù)據(jù)相對離散，正如李彥等[25]對雷公藤肝毒性的評價所述，造成這種現(xiàn)象的原因與每個個體免疫狀態(tài)、對藥物的敏感性以及基因表達差異有關(guān)。因此TP 作為臨床用藥還需進一步提高其靶向性，降低毒副作用，如何用于RA 臨床治療還有很大研究空間。