蔡楠，曹寧寧，趙利斌，3，裴帥，李曉璇，張琬靖，肖學鳳，劉昌孝

（1.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617；2.天士力控股集團有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410；3.北京振東光明藥物研究院，北京 100085；4.天津藥物研究院釋藥技術與藥物代謝動力學國家重點實驗室，天津 300301）

中藥質量是中藥臨床安全有效的基礎，是中藥產業(yè)發(fā)展的生命線[1]。中藥質量標準和質量控制關系到中醫(yī)藥科學和產業(yè)發(fā)展的國家戰(zhàn)略問題[2]。但現(xiàn)行質量標準主要以成分定性鑒別和定量分析為評價方法，雖然部分品種進行了較為系統(tǒng)的化學成分研究，但指標成分選擇往往缺乏特有性、有效性、溯源性等依據(jù)，不能充分保障中藥及產品的臨床療效和安全性，質量不能有效追蹤溯源。為此，2016 年，劉昌孝院士提出了中藥質量標志物（Q-marker）的核心概念和理論，引起了同行學者高度關注。Qmarker 的研究思路著眼于全過程基礎物質的特有、差異、動態(tài)變化以及質量的溯源性來建立中藥全程質量控制，以提高中藥質量控制的針對性和指向性[3]。概而言之，Q-marker 研究應基于有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五原則”而確定，完善現(xiàn)行質量標準中的諸多不足，保證臨床用藥的有效性和安全性。

血必凈注射液是由中國危重病急救醫(yī)學的奠基人和開拓者王今達教授歷經30 年研制成功的中藥復方制劑，其由紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸5 味中藥組成[4]。方中紅花活血散瘀止痛為君藥；赤芍涼血化瘀，川芎活血止痛，兩者共為臣藥；當歸養(yǎng)血活血，丹參活血祛瘀，清心除煩，兩者共為佐藥[5]。全方配伍既可活血化瘀，又可行氣養(yǎng)血，具有化瘀解毒之效。主治發(fā)熱、喘促、心悸、煩躁等瘀毒互結癥，臨床多用于治療因感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征，或配合治療多器官功能失常綜合征的臟器功能受損期[6]。

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發(fā)后，在沒有特效藥和疫苗的情況下，以中醫(yī)藥辨證施治、多靶點干預為基礎，篩選出包括血必凈注射液在內的一批有效方藥。血必凈注射液為國家衛(wèi)生健康委員會頒布《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》中推薦用藥，其臨床應用廣泛，療效確切，改善COVID-19 和重癥肺炎感染患者發(fā)熱、咳嗽及呼吸困難等臨床癥狀[7-8]。血必凈注射液可降低重癥型COVID-19 患者體溫，通過降低白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和C 反應蛋白（CRP）水平以減輕炎癥反應，下調血清中D-二聚體水平而抑制血小板黏附和聚集，改善微循環(huán)，顯著縮短核酸轉陰時間，對COVID-19 有明顯療效[9]。血必凈注射液能夠調節(jié)重癥肺炎患者血清中CD3+、CD4+和CD8+含量而增強免疫功能，促進肺部炎癥的消除；升高動脈血氧分壓（PaO2）和動脈血氧分壓與吸入氧濃度比值（PaO2/FiO2），并降低動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）來維持動脈血氣指標平衡，減輕患者肺部體征，有效治療重癥肺炎[10]。目前，血必凈注射液研究主要集中在臨床應用方面，其質量控制方面尚有欠缺。為保證臨床用藥的安全性和有效性，本文在梳理現(xiàn)代研究文獻基礎上，依據(jù)Q-marker“五原則”，對血必凈注射液Q-marker 的確定進行分析與論證，預測血必凈注射液的Q-marker，以期為血必凈注射液的后續(xù)臨床及其質量控制研究提供參考依據(jù)。

1 基于質量傳遞與溯源的Q-marker 預測分析

中藥化學成分是其功效表達的物質基礎，是反映中藥質量的客觀實質。因此，中藥質量控制應著眼于中藥形成的全過程，建立基于質量傳遞與溯源的全程質量控制體系[11]，保證中藥臨床的有效性。血必凈注射液化學成分復雜，目前對其單味藥材化學成分研究較多。采用質譜法從血必凈注射液的5 味藥材中共鑒別出170 余個化合物[12-33]，其中從紅花中辨識27 個化合物，赤芍中辨識59 個化合物，川芎中辨識35 個化合物，丹參中辨識53 個化合物，當歸中辨識27 個化合物。

由于各單味藥材在經提取純化等制備工藝制成中藥復方制劑的過程中，既有有效性成分的獲取，又有去粗取精、去偽存真的過程，因此，中藥復方制劑中的化學成分是其質量控制的主要指標，其上溯藥材源頭，下延體內的最終效應成分。已有研究采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜方法，對血必凈注射液化學成分進行表征和辨識，從血必凈注射液中共辨識80 余個化合物，其中從紅花中辨識13 個化合物，赤芍中辨識24 個化合物，川芎中辨識27 個化合物，丹參中辨識27 個化合物，當歸中辨識24 個化合物[34]。

中藥復方制劑的有效成分首先入血，再通過血液運輸?shù)竭_疾病治療靶點發(fā)揮治療作用，因此，入血成分才是最終的“效應成分”。從質量傳遞與溯源的角度，血中的效應成分是質量傳遞體系的最終環(huán)節(jié)，也是中藥質量標志物確定的重要依據(jù)。采用液質聯(lián)用方法，快速分析和辨識靜脈注射血必凈注射液后臨床患者和大鼠的入血成分[35-41]。靜脈注射血必凈注射液后從臨床患者和大鼠血漿中共辨識出30 余種入血成分，其中從紅花中辨識5 個化合物，赤芍中辨識12 個化合物，川芎中辨識11 個化合物，丹參中辨識7 個化合物，當歸中辨識7 個化合物。

綜上，通過對血必凈注射液原藥材、血必凈注射液及其入血成分的系統(tǒng)辨識，進一步將血必凈注射液中成分及其入血成分進行對比歸類，發(fā)現(xiàn)血必凈注射液32 個入血成分均可溯源到血必凈注射液及其單味藥材中，結果見開放科學（資源服務）標識碼（OSID），并明確其變化規(guī)律，見圖1。因此，以具有溯源性的32 個入血成分可作為血必凈注射液的Q-marker。

圖1 血必凈注射液中化學成分變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of chemical components change in Xuebijing Injection

2 基于成分特有性的Q-marker 預測分析

一個好的質量評價方法應具有對特定藥材的針對性和專屬性，以免“以假亂真”。中藥復方特有性成分大多來源于單味藥材的活性成分，其特征為含量高、具有與復方臨床應用相關的藥理作用等。血必凈注射液具有抗炎、保護血管內皮細胞、抗凝血等藥理作用，臨床多用于治療因感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征。故本研究通過分析血必凈注射液各單味藥材中含量高且具有抗炎、保護血管內皮細胞、抗凝血等藥理作用的化學成分，預測血必凈注射液具有特有性的Q-marker。

2.1 紅花成分的特有性分析 紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，主要含黃酮、酚酸類、生物堿等化學成分[42]。其中以羥基紅花黃色素A 為主的黃酮類成分是紅花主要成分，也是其他植物中較少見的成分。其不僅含量高，還具有抗炎、抗凝血等藥理作用，故羥基紅花黃色素A 可作為紅花的特有性成分。

2.2 赤芍成分的特有性分析 赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora PalL 或川赤芍Paeonia veitchii Lynch 的干燥根，主要含單萜及其苷類、黃酮類和酚酸類等化學成分。其中芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內酯苷等單萜及其苷類成分具有保護血管內皮細胞、抗炎等藥理作用，是赤芍的特征性成分[43-44]。因此，以芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內酯苷作為赤芍的特有性成分。

2.3 川芎、當歸成分的特有性分析 川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。川芎和當歸化學成分重疊度極高，兩者均含有苯酞類、多糖類、有機酸類等成分，難以從化學成分將兩者區(qū)分，故未單獨分析川芎或當歸的特有性成分，而是尋找當歸和川芎共同區(qū)別于血必凈注射液中其他藥材的特有性成分。血必凈注射液中川芎和當歸共有成分為藁本內酯、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯G、洋川芎內酯H、洋川芎內酯N等苯酞類成分，是區(qū)別于血必凈注射液中其他藥材的特有性成分[45]。因此，藁本內酯、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯G、洋川芎內酯H、洋川芎內酯N 可作為血必凈注射液中當歸和川芎的特有性成分。

2.4 丹參成分的特有性分析 丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，主要含有酚酸類和丹參酮類成分。其中丹參酮類成分包括隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA，但由于丹參酮類成分的藥理作用為抗氧化、抗腫瘤等，與血必凈注射液臨床治療因感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征無關，故其不能作為丹參的特有性成分[46-47]；而酚酸類成分中90%以上是丹酚酸B，同時丹酚酸B 也是丹參中含量最高的成分，其經水解等反應主要生成丹參素、原兒茶醛、丹酚酸A、迷迭香酸等，且上述成分具有與血必凈注射液臨床治療因感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征相關的抗炎、抗凝血、保護血管內皮細胞等藥理作用，可作為丹參的特有性成分[48]。文獻報道，李偉等[49]和楊靜等[50]預測含有丹參的中成藥的Q-marker 為酚酸類成分丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A 和丹酚酸B。因此，丹酚酸B、丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A 可作為丹參的特有性成分。

3 基于成分與藥效關聯(lián)的Q-marker 預測分析

質量控制的根本目的是對中藥有效性的控制，有效性體現(xiàn)中藥的“物質基礎”作用人體疾病主體的不同層面、不同方式的生物效應表達形式，而有效性成分是闡釋中藥的藥效物質基礎、作用原理以及配伍規(guī)律、指導臨床實踐的重要依據(jù)和研究路徑，將有效性成分納入中藥質量評價，才能反映中藥質量的完整性[51]。因此，“有效”是確定Q-marker的核心要素。現(xiàn)代藥理學研究表明血必凈注射液具有抗炎、調節(jié)免疫和保護血管內皮細胞等作用，臨床多用于治療肺炎等炎癥性疾病。

研究發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液中的羥基紅花黃色素A、丹參素、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、洋川芎內酯H和洋川芎內酯Ⅰ能降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6 和IL-8 等炎癥因子及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶2（COX-2）等炎癥相關酶的含量，表明上述成分具有抗炎作用，可增強血必凈注射液對機體炎癥的治療作用[42-55]。丹酚酸B可增加高脂日糧飼養(yǎng)小鼠外周血及脾臟CD4+、CD19+細胞數(shù)量，減少CD8+細胞數(shù)量，調節(jié)機體免疫，從而協(xié)同抗炎作用[56]。羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、芍藥苷和芍藥內酯苷均能夠提高內皮型一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化和一氧化氮（NO）代謝產物含量，調節(jié)內皮素-1（ET-1）、NO 平衡，增強血必凈注射液對血管內皮細胞保護作用，減輕炎癥導致的血管內皮損傷[57-59]。

綜上，羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、芍藥苷、芍藥內酯苷、丹參素、氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷是血必凈注射液發(fā)揮抗炎、調節(jié)免疫及保護血管內皮細胞作用的有效成分，可作為血必凈注射液Q-marker 的篩選參考。

4 基于網絡藥理學對復方配伍環(huán)境的Q-marker預測分析

復方是中藥臨床應用較多的形式，同一味中藥在不同復方中發(fā)揮的作用及其藥效物質基礎不盡相同，既體現(xiàn)在不同作用靶點、不同信號通路協(xié)同拮抗作用，又涉及吸收、代謝等體內過程的交互作用。因此，需針對具體疾病病因病機和治法治則，基于網絡藥理學，從復方配伍環(huán)境出發(fā)，根據(jù)中藥臨床運用時最終效應成分及其功效的臨床表達形式，確定復方Q-marker 的配伍特點。

基于網絡藥理學，建立血必凈注射液“藥材-成分-靶點-疾病”網絡，預測血必凈注射液治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的Q-marker[60]。選取血必凈注射液中包括黃酮類、單萜苷類、酚酸類等類型在內的36 個主要活性成分，采用TCMSP、PubChem、TargetNet 數(shù)據(jù)庫預測447 個活性成分靶點，并在Genecards 數(shù)據(jù)庫中挖掘259 個COVID-19疾病靶點。通過STRING10、DAVID 和KEGG 等相關數(shù)據(jù)庫，預測血必凈注射液治療COVID-19 主要通 過 其 活 性 成 分 作 用 于PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、MAPK1、IL-2、IL-6 和IL-10 等靶點有關的IL-17 信號通路、甲型流感、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性腸病等通路發(fā)揮作用。從網絡藥理學角度，闡釋血必凈注射液多成分、多靶點、多途徑治療COVID-19 的科學內涵。此外，還發(fā)現(xiàn)血必凈注射液36 個主要活性成分中有效成分綜合評分最高的10 個活性成分是槲皮素、沒食子酸、木犀草素、迷迭香酸、蘆丁、山萘酚、綠原酸、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 和芍藥苷，提示其是血必凈注射液治療COVID-19 的重要活性成分，可作為血必凈注射液的Q-marker。

5 基于成分可測性的Q-marker 預測分析

Q-marker 能夠為建立質量標準提供依據(jù)，因此，“成分的可測性”是確定Q-marker 的必要條件。由于中藥化學成分復雜，質量評價不僅需要以某些成分的含量作為指標，還需對中藥的整體“化學輪廓”進行研究。含量測定指標成分具有可測性，是質量評價最重要的指標，也是評價質量優(yōu)劣和合格限度的“金指標”。指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，能較為客觀地反映全方的物質基礎和化學成分群的整體性與復雜性，可用于評價質量的一致性[61]，故本研究從含量測定和指紋圖譜兩個方面預測血必凈注射液具有可測性的Q-marker。

首先通過含量測定預測血必凈注射液中具有可測性的Q-marker，《中華人民共和國藥典》“含量測定”項下絕大部分使用高效液相色譜（HPLC）法測定，未出現(xiàn)使用液質聯(lián)用法測定含量，故本研究預測可用HPLC 法測定的血必凈注射液的Q-marker。2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的紅花、赤芍、丹參、當歸、川芎的8 個含量測定指標成分羥基紅花黃色素A、山柰素、芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹酚酸B 和阿魏酸均采用HPLC 法測定[62]，表明其8 個指標成分均具有可測性。但各指標成分含量測定色譜條件不同，不能采用《中華人民共和國藥典》色譜條件同時測定血必凈注射液中化學成分的含量。冀蘭鑫等[63]建立同時測定血必凈注射液中沒食子酸、原兒茶醛、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H 和丹酚酸B 的HPLC 法，李娣等[64]建立不同波長下同時測定血必凈注射液中丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ的HPLC 法，兩種方法簡便、快速、準確，能有效控制血必凈注射液的質量。綜上，表明上述成分羥基紅花黃色素A、山柰素、芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、阿魏酸、沒食子酸、原兒茶醛、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H 和丹參素具有可測性，可作為血必凈注射液具有可測性的Q-marker。

其次根據(jù)指紋圖譜預測血必凈注射液中具有可測性的Q-marker。中藥為多成分的復雜體系，多年來《中華人民共和國藥典》一直采用1～2 個指標成分控制中藥質量，這與中藥所含化學成分復雜、發(fā)揮藥效時多成分、多靶點協(xié)同作用的特性不甚吻合。為加強中藥質量的整體控制，指紋圖譜在《中華人民共和國藥典》中的應用逐漸增加，從整體化學輪廓的角度評價中藥質量概貌，結合含量測定，使中藥質量可控性明顯增強。采用HPLC 法建立10 批血必凈注射液指紋圖譜，相似度均大于0.90，標定18 個共有峰，經與對照品比對，共指認了6 個色譜峰，分別為原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、丹酚酸B[65]，增加血必凈注射液質量的整體可控性。故基于Q-marker“五原則”的可測性，從含量測定和指紋圖譜兩個方面預測血必凈注射液中具有可測性的成分有羥基紅花黃色素A、丹參素、山柰素、芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、沒食子酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、原兒茶醛，可作為血必凈注射液的Q-marker。

綜上，基于Q-marker 的傳遞與溯源、特有、有效、復方配伍和可測的“五原則”，建立血必凈注射液Q-marker 發(fā)現(xiàn)的研究路徑，見圖2。在血必凈注射液Q-marker 預測分析中，發(fā)現(xiàn)不同原則下預測得到的血必凈注射液Q-marker 有所差異，故選取與血必凈注射液有效性密切相關、具有溯源性、可測性強、特有性好的羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、芍藥苷、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H 作為血必凈注射液的Q-marker，具體信息見表1 及圖3。

圖3 血必凈注射液Q-marker 分子結構信息Fig.3 Molecular structure information of Q-markers of Xuebijing injection

表1 血必凈注射液的Q-marker 信息Tab.1 Information of Q-markers of Xuebijing Injection

圖2 基于“五原則”的血必凈注射液的Q-marker 發(fā)現(xiàn)的研究路徑Fig.2 Research approach of Q-marker of Xuebijing injection based on“five principles”

6 結語

血必凈注射液是中國唯一被批準治療全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙的中藥注射劑，但其未被《中華人民共和國藥典》收錄。2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定了血必凈注射液中5 味單藥材的指標成分含量，但各單味藥指標成分含量測定方法不盡相同。因此，本研究為保證血必凈注射液的臨床用藥安全有效，基于Q-marker 的“五原則”預測血必凈注射液的Q-marker：1）通過對血必凈注射液原藥材、注射液及其入血成分的系統(tǒng)辨識及對比歸屬，預測32 個入血成分作為血必凈注射液中具有質量傳遞與溯源性的Q-marker。2）從含量測定和指紋圖譜兩個方面，預測13 個化學成分作為血必凈注射液中具有可測性的的Q-marker。3）根據(jù)化學成分的含量高低及藥理作用，分別預測14 個化學成分作為血必凈注射液中具有特有性的Qmarker 和9 個化學成分作為血必凈注射液中與藥效關聯(lián)的Q-marker。4）基于網絡藥理學闡釋血必凈注射液君臣佐使協(xié)同發(fā)揮COVID-19 藥效的配伍特色，并預測10 個活性成分作為體現(xiàn)血必凈注射液復方配伍環(huán)境的Q-marker。結果發(fā)現(xiàn)不同原則下預測血必凈注射液Q-marker 有所差異，但中藥復方Q-marker 應同時滿足“五原則”。故選取與血必凈注射液有效性密切相關、具有溯源性、可測性強、特有性好的羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、芍藥苷、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H 作為血必凈注射液的Q-marker，后期通過建立同時測定血必凈注射液中羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、芍藥苷、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H 含量的HPLC 方法，評價血必凈注射液的質量優(yōu)劣，為血必凈注射液的臨床研究和質量控制研究提供依據(jù)。