王子延，吳丹，牛璐，王躍飛，柴欣

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥化學(xué)與分析重點實驗室，天津 301617）

美洲大蠊（Periplaneta americana L.），俗稱蟑螂，為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲。美洲大蠊入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要用于治療癥瘕積聚、小兒疳積和瘡癰腫毒[1]。目前，以美洲大蠊為主要原料制成的上市藥物有康復(fù)新液、心脈隆、肝龍膠囊等?，F(xiàn)代藥理研究表明，美洲大蠊具有創(chuàng)傷修復(fù)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤[2-4]等良好的生物活性，其化學(xué)成分研究主要聚焦氨基酸、核酸類、酚類、神經(jīng)肽、信息素等，但從提取物中分離的有效成分很少[5]。有研究認(rèn)為中腸是昆蟲解毒代謝和應(yīng)激反應(yīng)的中心[6]，豐富的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可能是美洲大蠊具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和生存能力的重要原因。近年來，隨著腸道微生物研究的興起與深入，糞菌移植療法發(fā)展迅速，這與傳統(tǒng)中醫(yī)的糞便入藥殊途同歸，兩者均利用糞便達(dá)到治療疾病的目的。為闡明美洲大蠊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究首次以糞便為載體，開展美洲大蠊腸道菌群代謝產(chǎn)物的富集制備，從全新角度尋找美洲大蠊的活性成分。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法對美洲大蠊糞便提取物進(jìn)行初步的抗氧化活性研究，半抑制濃度（IC50）為44.53 μg/mL，顯示其具有良好的抗氧化活性。采用75%甲醇對美洲大蠊糞便進(jìn)行超聲提取，減壓濃縮后經(jīng)大孔吸附樹脂富集有效成分，通過制備高效液相色譜法分離得到12 個化合物，分別鑒定為：鄰苯二酚（1）、苯甲酸（2）、羥吲哚（3）、5-羥基吲哚啉-2-酮（4）、8-羥基喹啉-2-羧酸（5）、6-羥基-2-喹啉酮（6）、8-羥基-2-喹啉酮（7）、2-喹啉酮（8）、6-羥基-3，4-二氫-2-喹啉酮（9）、5-羥基-3，4-二氫-2-喹啉酮（10）、8-羥基-3，4 二氫-2-喹啉酮（11）、3，4-二氫-2-喹啉酮（12）?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～12 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1～12

1 儀器、試劑與材料

BRUKER AV Ⅲ核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司），SHIMADZU LC-MS-IT-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀（日本SHIMADZU 公司），Agilent 1260 制備液相色譜儀（美國Agilent 公司），METTLER TOLEDO 萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），R-215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社），SCIENTZ 25-12 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），Milli-Q 超純水儀（美國Milli-Q 公司），TGL-16C 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），D101 大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司），ZORBAX DBC18色譜柱（21.2 mm×250 mm，7 μm），Sun Fire C18OBD色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm），F(xiàn)DU-1110/2110 冷凍干燥機(jī)（日本東京理化器械株式會社），Costar 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning 公司），F(xiàn)lexStation 3 多功能讀板機(jī)（美國Molecular Devices 公司）。

氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）購自美國Cambridge Isotope Laboratories 公司，甲醇（分析純、質(zhì)譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）、甲酸（質(zhì)譜純）均購自美國Fisher 公司，其余試劑均為分析純。DPPH 購自美國Sigma-Aldrich 公司，維生素C 購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

本研究所用美洲大蠊糞便為云南騰藥制藥股份有限公司石頭山美洲大蠊GAP 養(yǎng)殖基地提供的成蟲期美洲大蠊糞便，美洲大蠊的飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照GAP 標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將清掃的美洲大蠊中的蟲體、蟲皮和蟲卵篩除后，進(jìn)行揀選、漂洗和晾曬，低溫運輸，儲存于-20 ℃冰箱中。

2 實驗方法

2.1 美洲大蠊糞便提取物的制備 美洲大蠊成蟲糞便2.1 kg，加入21 L 75%甲醇水溶液，超聲提取1 h，過濾，提取液減壓回收溶劑得總浸膏（168 g）。總浸膏用10 倍量的水混懸，采用大孔吸附樹脂分離，依次用水、甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，得甲醇洗脫液的浸膏（40 g）；加入10 倍量的70%甲醇溶液溶解浸膏，置于4 ℃冰箱，靜置12 h，收集上清液；上清液加入等體積水，置于4 ℃冰箱，再靜置12 h，4 000 g 離心30 min，重新收集美洲大蠊糞便提取物上清液（750 mL）。

2.2 DPPH 自由基的清除實驗 取美洲大蠊糞便提取物上清液，減壓回收溶劑，真空干燥得提取物粉末。

精密稱定美洲大蠊糞便提取物粉末20 mg，置于5 mL 容量瓶中，加適量甲醇，超聲處理10 min，取出，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為4 048.00 μg/mL 的儲備液。將儲備液用甲醇逐級稀釋為系列工作溶液，濃度依次為：2 024.00、1 012.00、506.00、269.87、202.40、101.20、40.48、20.24、10.12、5.06 μg/mL。

精密稱定DPPH 25.00 mg，置于250 mL 棕色容量瓶中，用少量甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻，得100 μg/mL DPPH 甲醇工作溶液。以維生素C 作為陽性對照，精密稱定維生素C 2.8 mg，置于25 mL 容量瓶中，用適量甲醇溶解，超聲處理10 min 后取出，放冷至室溫，并定容至刻度，得到濃度為111.60 μg/mL的維生素C 儲備液。用甲醇將儲備液逐級稀釋為工作溶液，濃度分別為：89.28、74.40、55.80、37.20、27.90、18.60、11.16、5.58、2.23 μg/mL。

藥物組加入50 μL 不同濃度提取物溶液和150 μL DPPH 甲醇溶液，陽性對照組以50 μL 不同濃度的維生素C 溶液替代美洲大蠊糞便提取物溶液，空白對照組加入50 μL 樣品溶液和150 μL 甲醇溶液，DPPH 對照組加入50 μL 甲醇溶液和150 μL DPPH 甲醇溶液。各組均平行3 個復(fù)孔，取其平均值。將加入溶液的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于多功能讀板機(jī)中，在512 nm（37 ℃）處檢測其動力學(xué)過程，每45 s 讀數(shù)1 次，連續(xù)記錄45 min，記錄最終A 值。所有實驗平行操作3 次。DPPH 清除活性（%）=[1-（A藥物-A空白）/A對照]×100%，其中A藥物為DPPH+樣品吸光度值；A空白為甲醇+樣品吸光度值；A對照為DPPH+甲醇吸光度值。分別計算系列濃度的陽性藥維生素C 和測試樣品美洲大蠊糞便樣品供試品溶液的DPPH 清除活性。采用OriginPro 8.5.1 軟件繪制劑量-效應(yīng)曲線，計算IC50。

2.3 美洲大螊糞便提取物的分離純化 采用制備液相色譜（ZORBAX DB-C18，21.2 mm×250 mm，7 μm），通過0.05%甲酸水-甲醇梯度洗脫（0～40 min，5%～80%甲醇；40～50 min，80%～100%甲醇），從美洲大蠊糞便提取物上清液中初步得到19 份樣品組分（按保留時間順序依次編號為Fr 1～19，0～6 min 為Fr 1，6～40min 每2 min 收集1 個流分，40～50 min 為Fr 19）。將7、9～16 號共9 個組分別采用制備液相色譜（Sun Fire C18OBD Prep Column，10 mm×250 mm，5 μm）經(jīng)過0.05%甲酸水-甲醇梯度洗脫，進(jìn)一步分離純化，共得到12 個化合物。Fr 7（40 mg）經(jīng)梯度洗脫（0～15 min，15%～26%甲醇）制備得到化合物4（10 mg）。Fr 9（85 mg）經(jīng)梯度洗脫（0～30 min，17%甲醇）制備得到化合物1（1 mg）和化合物9（9.8 mg）。Fr 10（100 mg）經(jīng)梯度洗脫（0～35 min，20%甲醇）制備得到化合物6（2 mg）和化合物10（2 mg）。Fr 13（100 mg）經(jīng)梯度洗脫（0～25 min，32%甲醇）制備得到化合物7（10 mg）、化合物3（6 mg）和化合物11（10 mg）。Fr 14（95 mg）通過梯度洗脫（0～25 min，38%甲醇）制備得到化合物8（6 mg）。Fr 15（95 mg）通過梯度洗脫（0～35 min，40%甲醇）制備得到化合物12（10 mg）和化合物2（1.7 mg）。Fr 16（47 mg）經(jīng)過梯度洗脫（0～20 min，20%～80%甲醇；20～23 min，80%甲醇）制備得到化合物5（15 mg）。

3 結(jié)果

3.1 美洲大蠊糞便提取物對DPPH 自由基的清除活性 DPPH 自由基清除能力可以作為抗氧化活性的衡量指標(biāo)，本研究采用分光光度法對DPPH 自由基清除率進(jìn)行計算并衡量美洲大蠊糞便提取物的抗氧化活性。由于樣品工作溶液和DPPH 甲醇溶液以1∶3 體積比加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，因此，維生素C 溶液和美洲大蠊糞便提取物樣品溶液測試終濃度為樣品工作液濃度的1/4；以終濃度計算樣品溶液的DPPH 清除活性。維生素C 和美洲大蠊糞便提取物的DPPH 清除活性的劑量-效應(yīng)曲線見圖2 及圖3。在DPPH 終濃度為75.00 μg/mL 條件下，維生素C 清除DPPH 的IC50為8.66 μg/mL。美洲大蠊糞便提取物清除DPPH 自由基的IC50值為44.53 μg/mL，說明其具有一定的抗氧化能力。

圖2 不同濃度的維生素C 對DPPH 自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of DPPH free radical of vitamin C in different concentrations

圖3 美洲大蠊糞便提取物對DPPH 自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of DPPH free radical of the extract of feces of the Periplaneta americana L.in different concentrations

3.2 美洲大蠊糞便提取物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1 為黃色粉末，C6H6O2；ESI-MS：[M-H]-，m/z 109.033 7；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：8.93（2H，brs，-OH），6.71～6.73（2H，m，H-3，6），6.58～6.61（2H，m，H-4，5）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：145.8（C-1，2），119.7（C-4，5），116.2（C-3，6）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[7]相符，可以確定化合物1 為鄰苯二酚。

化合物2 為白色結(jié)晶，C7H6O2；ESI-MS：[M-H]-，m/z 121.032 7；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.96（2H，d，J=7.8 Hz，H-2，6），7.63（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-4），7.50（2H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-3，5）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：167.8（-COOH），133.3（C-4），131.2（C-1），129.7（C-2，6），129.0（C-3，5）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[8]相符，可以確定化合物2 為苯甲酸。

化合物3 為白色針狀結(jié)晶，C8H7NO；ESI-MS：[M+H]+，m/z 134.0577；1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：10.36（1H，brs，-NH），7.20（1H，d，J=7.8 Hz，H-4），7.16（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-6），6.92（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-5），6.81（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），3.46（2H，s，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：176.8（C-2），144.2（C-8），127.9（C-6），126.2（C-4），124.8（C-5），121.6（C-9），109.6（C-7），36.2（C-3）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[9]相符，可以確定化合物3 為羥吲哚。

化合物4 為白色無定形粉末，C8H7NO2；ESIMS：[M+H]+，m/z 150.052 9；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.05（1H，brs，-NH），8.92（1H，brs，-OH），6.67（1H，brs，H-4），6.60（1H，d，J=8.0 Hz，H-7），6.55（1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6），3.38（2H，s，H-3）；13CNMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：176.5（C-2），152.7（C-5），136.0（C-8），127.4（C-9），113.8（C-6），112.9（C-4），109.9（C-7），36.7（C-3）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[10]相符，可以確定化合物4 為5-羥基吲哚啉-2-酮。

化合物5 為黃色顆粒狀結(jié)晶，C10H7NO3；ESIMS：[M+H]+，m/z 190.045 7，[M-H]-，m/z 188.0362；1HNMR（400 MHz，CD3OD）δ：8.43（1H，d，J=8.4 Hz，H-4），8.18（1H，d，J=8.4 Hz，H-3），7.59（1H，dd，J=7.6，8.4 Hz，H-6），7.45（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），7.19（1H，d，J=7.6 Hz，H-7）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.5（-COOH），154.0（C-8），144.9（C-2），137.8（C-4），137.4（C-9），130.3（C-6），130.1（C-10），120.3（C-3），117.5（C-5），111.8（C-7）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[11]相符，可以確定化合物5 為8-羥基-2-喹啉酸。

化合物6 為黃色無定形粉末，C9H7NO2；ESIMS：[M+H]+，m/z 162.052 6，[M-H]-，m/z 160.042 1；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：11.53（1H，brs，-OH），8.27（1H，brs，-NH），7.77（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.15（1H，d，J=9.0 Hz，H-8），7.00（1H，d，J=2.4 Hz，H-5），6.98（1H，dd，J=9.0，2.4 Hz，H-7），6.43（1H，d，J=9.6 Hz，H-3）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[12]相符，可以確定化合物6 為6-羥基-1H-2-喹啉酮。

化合物7 為白色顆粒，C9H7NO2；ESI-MS：[M+H]+，m/z 162.052 2，[M-H]-，m/z 160.042 0；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：10.47（1H，s，-NH），10.28（1H，s，-OH），7.85（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.11（1H，dd，J=8.4，1.2 Hz，H-5），7.00（1H，dd，J=8.4，7.8 Hz，H-6），6.96（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），6.49（1H，d，J=9.6 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：161.8（C-2），144.0（C-8），140.9（C-4），128.5（C-9），122.6（C-3），122.3（C-6），120.5（C-10），118.7（C-5），115.0（C-7）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[13]相符，可以確定化合物7 為8-羥基-2-喹啉酮。

化合物8 為白色針狀結(jié)晶，C9H7NO；ESI-MS：[M+H]+，m/z 146.058 2；1H-NMR（600 MHz，DMSOd6）δ：11.75（1H，brs，-NH），7.90（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.66（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），7.50（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-7），7.31（1H，d，J=7.8 Hz，H-8），7.17（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-6），6.50（1H，d，J=9.6 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：162.4（C-2），140.7（C-9），139.4（C-4），130.8（C-5），128.3（C-7），122.4（C-6），122.2（C-3），119.6（C-10），115.6（C-8）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[14]相符，可以確定化合物8 為2-喹啉酮。

化合物9 為白色針狀結(jié)晶，C9H9NO2；ESI-MS：[M+H]+，m/z 164.068 4，[M-H]-，m/z 162.056 7；1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：9.80（1H，brs，-OH），9.05（1H，brs，-NH），6.66（1H，d，J=8.4 Hz，H-8），6.58（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.53（1H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-7），2.77（2H，t，J=7.8 Hz，H-4），2.37（2H，t，J=7.8 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：170.1（C-2），152.8（C-6），130.7（C-9），125.2（C-10），116.3（C-8），115.0（C-5），113.9（C-7），30.9（C-3），25.6（C-4）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[15]相符，可以確定化合物9 為6-羥基-3，4-二氫-1H-2-喹啉酮。

化合物10 為黃色無定形粉末，C9H9NO2；ESIMS：[M+H]+，m/z 164.069 5，[M-H]-，m/z 162.057 5；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：9.94（1H，brs，-OH），8.25（1H，brs，-NH），6.90（1H，dd，J=8.4，7.8 Hz，H-7），6.44（1H，d，J=8.4 Hz，H-8），6.32（1H，d，J=7.8 Hz，H-6），2.76（2H，t，J=7.2 Hz，H-4），2.39（2H，t，J=7.8 Hz，H-3）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[16]相符，可以確定化合物10 為5-羥基-3，4-二氫-2-喹啉酮。

化合物11 為白色顆粒，C9H9NO2；ESI-MS：[M+H]+，m/z 164.068 7，[M-H]-，m/z 162.056 6；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：9.83（1H，brs，-OH），8.80（1H，s，-NH），6.75（1H，dd，J=7.8，7.2 Hz，H-6），6.70（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），6.63（1H，d，J=7.2 Hz，H-5），2.83（2H，t，J=7.2 Hz，H-4），2.43（2H，t，J=7.8 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：170.0（C-2），144.4（C-8），126.3（C-9），125.2（C-10），122.6（C-6），118.7（C-5），114.1（C-7），31.1（C-3），25.5（C-4）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[17]相符，可以確定化合物11 為8-羥基-3，4-二氫-2-喹啉酮。

化合物12 為白色結(jié)晶，C9H9NO；ESI-MS：[M+H]+，m/z 148.073 1；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：10.05（1H，brs，-NH），7.15（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），7.12（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-7），6.91（1H，dd，J=7.8，7.8 Hz，H-6），6.87（1H，d，J=7.8 Hz，H-8），2.86（2H，t，J=7.8 Hz，H-4），2.44（2H，t，J=7.8 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：170.7（C-2），138.8（C-9），128.2（C-10），127.5（C-8），124.0（C-7），122.4（C-6），115.5（C-5），30.9（C-3），25.3（C-4）。以上理化性質(zhì)以及數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[15]相符，可以確定化合物12 為3，4-二氫-2-喹啉酮。

4 討論

自由基性質(zhì)不穩(wěn)定、活性強(qiáng)，機(jī)體受內(nèi)、外環(huán)境影響而產(chǎn)生大量的自由基損傷組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，被認(rèn)為是引起機(jī)體衰老、誘發(fā)腫瘤等疾病的重要原因[18]。研究表明，美洲大蠊抗衰老活性部位提取物對DPPH 自由基具有較好的清除作用[19]，而美洲大蠊抗腫瘤活性成分對DPPH 自由基的清除率也具有明顯的濃度依賴性[20]。但美洲大蠊的活性成分尚不明確，相關(guān)化學(xué)成分研究多集中于小分子肽、氨基酸和短鏈脂肪酸[21-23]。本研究以美洲大蠊糞便為研究對象，在明確其提取物具有明顯的DPPH自由基清除作用的基礎(chǔ)上，從中分離并鑒定了12 個化合物，并且多為喹啉酮類化合物，文獻(xiàn)報道的此類化合物主要為化學(xué)合成產(chǎn)物，天然產(chǎn)物報道較少。該研究為美洲大蠊的深入研究以及合理開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。