李生茂，李倩茹，張馨予，林雪晶，雷 蕾，周春陽

（川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637100）

益智為姜科山姜屬植物益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的干燥成熟果實(shí)，為傳統(tǒng)藥食同源中藥，是海南產(chǎn)道地藥材，也是“四大南藥”之一，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效[1]。除藥用外，益智在食品、保健品等領(lǐng)域也應(yīng)用廣泛。早在晉代《南方草木狀》中就有關(guān)于“……嘗以益智粽餉魏武帝”的記載[2]。海南部分地區(qū)也有將益智鮮果腌漬后食用的習(xí)俗，具有治脹氣及腹痛、助消化的作用。近年來，以益智為主料還制成果脯、酒、蜜餞、糖及茶等多種食品或保健品，具有較高的開發(fā)價(jià)值[3-4]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分是益智重要的活性物質(zhì)之一，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抑菌等多種藥理活性[5-7]。目前，關(guān)于益智總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究較少，且未見有總黃酮與抗氧化活性相關(guān)性的研究報(bào)道。為了更好地開發(fā)利用益智藥材資源，本文以益智總黃酮提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)考察甲醇濃度、超聲時(shí)間及液料比對(duì)益智總黃酮提取率影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了其超聲輔助提取工藝，采用DPPH、ABTS 和FRAP 法評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性，并探討了益智總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），由美國Sigma 公司生產(chǎn)；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、過硫酸鉀，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；蘆丁，由四川省維克奇生物科技有限公司生產(chǎn)；維生素C，由廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)；甲醇（分析純），由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；益智，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李毅主任中藥師鑒定為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的干燥成熟果實(shí)，樣品S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S10 的產(chǎn)地為海南，樣品S3 的產(chǎn)地為云南，樣品S4 的產(chǎn)地為廣東。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Muitiskan Go 全波長酶標(biāo)儀，Mettle AE 240 十萬分之一電子天平，KQ-300DE 型超聲清洗器，N4 紫外分光光度計(jì)，TGL-18 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁適量，加甲醇配制成濃度為1 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 至10 mL 具塞比色管中，再依次加入4 mL 1%AlCl3溶液，2 mL pH 為5.4 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，并加甲醇至10 mL，搖勻，40 ℃水浴靜置20 min，于410 nm 處測定吸光度值[8]。以蘆丁對(duì)照品溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=25.102C-0.011 2（R2=0.999 2），蘆丁在0.005～0.03 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 益智總黃酮的提取

取各益智樣品粗粉（過2 號(hào)篩），每份約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入一定體積的不同濃度甲醇，稱定質(zhì)量，設(shè)定超聲功率100 W，超聲提取，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，并用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，于7 000 r/min 離心10 min，取上清液，備用。

1.2.3 益智總黃酮提取率的測定

精密吸取益智樣品溶液0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中，按“1.2.1”中的方法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中總黃酮濃度，并按以下公式計(jì)算總黃酮提取率。

w（%）=（c×V×n）/m×100

式中：w 表示總黃酮提取率（%）；c 表示提取液中總黃酮濃度（mg/mL）；V 表示提取液體積（mL）；n 表示稀釋倍數(shù)；m 表示益智樣品取樣量（mg）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 甲醇濃度對(duì)益智總黃酮提取率的影響

以液料比20∶1（mL/g），采用不同濃度的甲醇（60%、70%、80%、90%和100%）對(duì)益智S10 樣品超聲提取60 min（超聲功率100 W），考察不同濃度甲醇對(duì)益智總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響

固定液料比20∶1（mL/g），采用100%濃度的甲醇對(duì)益智S10 樣品分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min（超聲功率100 W），考察不同超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響

分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），采用100%濃度的甲醇對(duì)益智S10 樣品超聲提取60 min（超聲功率100 W），考察不同液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)（Y），甲醇濃度、超聲時(shí)間、液料比為自變量（X），采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)，對(duì)益智總黃酮的超聲輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.6 益智樣品總黃酮含量的測定

精密稱取益智樣品（S1～S10）粗粉，約1 g，按“1.2.5”中確定的最佳提取工藝條件制備樣品溶液，精密吸取0.5 mL 至10 mL 具塞比色管中，按“1.2.3”中的方法測定并計(jì)算總黃酮含量。

式中：c 為提取液中總黃酮濃度（mg/mL）；V 為提取液體積（mL）；m 為益智樣品取樣量（g）。

1.2.7 益智抗氧化活性的測定

1.2.7.1 DPPH 法測定抗氧化活性

分別取不同濃度供試樣品溶液與230.50 μmol/L DPPH 甲醇溶液各0.15 mL，置于96 孔板中，迅速混勻，40 ℃避光反應(yīng)60 min，于517 nm 處測定吸光度值，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，按以下公式計(jì)算清除率[9]，并以清除率（Y）對(duì)樣品濃度（X）進(jìn)行對(duì)數(shù)回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)樣品的濃度（IC50），另取陽性對(duì)照VC 溶液，同法測得其IC50值。

式中：A0為空白吸光度值（即以甲醇代替樣品）；Ai為樣品吸光度值。

1.2.7.2 ABTS 法測定抗氧化活性

將濃度為6.83mmol/L 的ABTS 溶液與2.46 mmol/L過硫化鉀溶液等體積混合，室溫暗處靜置12 h，再加蒸餾水稀釋，使其在734 nm 處的吸光值在0.70±0.02左右[10]。精密吸取不同濃度的供試品溶液與ABTS 液各0.15 mL，置于96 孔板中，迅速混勻，40 ℃避光反應(yīng)70 min，于734 nm 處測定吸光度，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，按以下公式計(jì)算清除率，并以清除率（Y）對(duì)樣品濃度（X）進(jìn)行對(duì)數(shù)回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)樣品的濃度（IC50），另取陽性對(duì)VC 溶液，同法測得其IC50值。

式中：A0為空白吸光度值（即以甲醇代替樣品）；Ai為樣品吸光度值。

1.2.7.3 FRAP 法測定抗氧化能力

將300 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（用40 mmol/L HCl 配制）、20 mmol/L 的FeCl3溶液按體積比10∶1∶1 的比例混勻，37 ℃保溫30 min，得FRAP 工作液[11]。精密吸取不同濃度的FeSO4·7H2O 溶液5 μL 與TPTZ 工作液150 μL 置于96 孔板中，迅速混勻，30 ℃反應(yīng)5 min，于593 nm 處測定吸光度值。以FeSO4·7H2O 溶液濃度C（mmol/L）對(duì)吸光度值（Y）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=6.464 9C+0.038 4，R2=0.999 0，F(xiàn)eSO4·7H2O 線性范圍為0.006 3～0.187 5 mmol/L。

取益智樣品溶液5 μL 與TPTZ 工作液150 μL置于96 孔板中，迅速混勻，30 ℃反應(yīng)5 min，于593 nm處測定吸光度值，樣品的總抗氧化能力以Fe2+的還原當(dāng)量（mmol/L）表示。另取陽性對(duì)照VC 溶液，同法測定其總抗氧化能力。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 軟件作圖，Design-Expert 7.1.3.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，SPSS13.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 甲醇濃度對(duì)益智總黃酮提取率的影響

如圖1 所示，益智總黃酮提取率隨甲醇濃度的增加而增加，當(dāng)濃度達(dá)到90%時(shí)，其提取率增加趨勢相對(duì)變緩，100%甲醇時(shí)提取率達(dá)到最高，這可能與益智中主要的黃酮類化合物多以黃酮類或黃酮醇類苷元（楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山柰素、Kaempferol-7,4'-dimethyl ether、鼠李檸檬素和生松素）的形式存在有關(guān)[7]。

圖1 甲醇濃度對(duì)益智總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of methanol contents on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響

如圖2 所示，在本試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響較小，提取率總體隨著超聲時(shí)間的延長有緩慢增加趨勢，在提取30 min 時(shí)提取率達(dá)到最高，此后隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長，總黃酮提取率趨于平穩(wěn)。說明在黃酮含量一定的情況下，在提取一定時(shí)間后，提取液中總黃酮與藥材細(xì)胞中總黃酮濃度已達(dá)到平衡，再延長超聲時(shí)間則浪費(fèi)時(shí)間和能源。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasound time on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.1.3 液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響

如圖3 所示，隨著提取溶劑用量的增加，益智總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)液料比增加到20∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到最大值，而后隨液料比的增加，提取率相對(duì)穩(wěn)定，增幅較小。原因可能是液料比達(dá)到20∶1（mL/g）時(shí)，益智樣品中總黃酮幾乎完全被提取，故增加提取溶劑用量后總黃酮提取率增幅也不顯著。

圖3 液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化益智總黃酮超聲輔助提取最佳工藝試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型的建立與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

通過Design-Expert 7.1.3.1 軟件對(duì)表2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到總黃酮提取率（Y）對(duì)甲醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）的回歸模型方程為：Y=-1.828 95+0.036 152A+1.017 5×10-3B+0.030 63C-4.75×10-5AB-1×10-5AC-1.8×10-4BC-1.342 5×10-4A2+1.257 5×10-4B2-4.87×10-4C2。

響應(yīng)曲面圖可更加直觀地反映甲醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）3 個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)益智總黃酮提取率的影響（圖4）。響應(yīng)曲面的陡峭程度與該交互作用的顯著性成正比，曲面越陡峭，說明交互作用越顯著。等高線的橢圓率也可以直觀地反映交互作用的強(qiáng)弱，等高線橢圓率越大，說明該交互作用越顯著[13]。由圖4 可知，AB、BC 及AC 之間交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響均不顯著。

圖4 各因素間的交互作用對(duì)益智總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagrams showing the effects of interactive items on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.2.2 最佳提取工藝條件的確定

通過響應(yīng)面分析確定益智總黃酮最佳提取工藝條件為：甲醇濃度100%，超聲時(shí)間20 min，液料比25∶1（mL/g），該條件下益智總黃酮提取率的理論值為0.766%。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，益智總黃酮平均提取率為0.757%，該結(jié)果與理論值比較接近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.65%，表明響應(yīng)面模型可靠性較高，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 10 個(gè)批次益智總黃酮含量比較

如表4 所示，10 個(gè)批次益智的總黃酮含量有明顯差異，含量在2.917～7.565 mg/g，最大值是最小值的2.5 倍左右，含量的高低順序依次為：S10＞S5＞S9＞S7＞S2＞S3＞S8＞S6＞S1＞S4，但影響各批次益智總黃酮含量高低的具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

表4 10 個(gè)批次益智總黃酮含量Table 4 Total flavonoids contents of AOF 單位：mg/g

2.4 10 個(gè)批次益智抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 清除DPPH 自由基能力

DPPH 自由基是一種人工合成的、比較穩(wěn)定的含氮自由基，常被用來評(píng)價(jià)物質(zhì)的體外抗氧化活性。其甲醇或乙醇溶液呈深紫色，在517 nm 處有強(qiáng)吸收。當(dāng)向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物質(zhì)時(shí)，其N 原子上的孤對(duì)電子被配對(duì)而褪色，褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可以根據(jù)溶液褪色的程度來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。即樣品與DPPH 自由基反應(yīng)后混合溶液顏色越淺，在517 nm 的吸光度越小，樣品清除DPPH 自由基的能力越強(qiáng)[14]。由表5 可知，10個(gè)批次益智樣品對(duì)DPPH 自由基均有較好的清除能力，IC50值在0.851～3.188 mg/mL（相當(dāng)于生藥）之間，但均弱于VC。

2.4.2 清除ABTS 自由基能力

ABTS 二銨鹽經(jīng)過硫酸鉀氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基，在734 nm 處有強(qiáng)吸收。當(dāng)體系中有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，ABTS 自由基與之反應(yīng)，顏色變淡。因此可以根據(jù)溶液顏色變化的程度來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力[15]。即樣品與ABTS 自由基反應(yīng)后混合溶液顏色越淡，在734 nm 的吸光度值越小，樣品清除ABTS 自由基的能力越強(qiáng)。由表5 可知，10 個(gè)批次益智樣品對(duì)ABTS 自由基均有較好的清除能力，IC50值在0.642～1.789 mg/mL（相當(dāng)于生藥）之間，但均于弱于VC。

表5 10 個(gè)批次益智總黃酮清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和總抗氧化能力Table 5 Total flavonoids contents,DPPH free radical,ABTS free radical scavenging capacities and total antioxidant capacities of AOF

2.4.3 總抗氧化能力

在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ 可被樣品中抗氧化物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ，并呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，在593 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)體系中的Fe3+-TPTZ 過量時(shí)，檢測Fe2+-TPTZ 的生成量可評(píng)價(jià)樣品的還原能力，即總抗氧化能力[16]。由表5 可知，10 個(gè)批次益智樣品均有較好的總抗氧化能力，其FRAP 值在0.029～0.111 mmol/L之間，但均弱于VC。

2.5 益智總黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確益智抗氧化活性與其總黃酮含量之間的關(guān)系，采用SPSS13.0 軟件Pearson 相關(guān)分析法對(duì)益智中總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)性進(jìn)行了分析。由表6 結(jié)果顯示，益智總黃酮含量與清除DPPH 自由基的IC50值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.679；總黃酮含量與總抗氧化能力FRAP 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.761；總黃酮含量與清除ABTS 自由基IC50值也呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.431，但相關(guān)性不顯著。分析原因，一方面可能是益智中除了富含黃酮類成分外，還存在原兒茶酸、多酚等類抗氧化成分[7,17]，其抗氧化作用的發(fā)揮是包括黃酮類成分在內(nèi)的多類成分共同作用的結(jié)果，另一方面也可能是益智黃酮包含有大量黃酮類及黃酮醇類化合物，具有多樣性[7]，其與不同自由基的反應(yīng)能力及機(jī)制有所不同。故益智總黃酮的含量與清除DPPH自由基的IC50值和總抗氧化能力FRAP 值具有顯著的相關(guān)性，而與清除ABTS 自由基的IC50值相關(guān)性不顯著，但具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

表6 益智總黃酮含量與其抗氧化活性的Pearson 相關(guān)分析Table 6 Pearson correlation analysis of total flavonoids contents and antioxidant activities of AOF

3 結(jié)論

在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)益智總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定益智總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝為：甲醇濃度100%，超聲時(shí)間20 min，液料比25∶1（mL/g），在該條件下益智總黃酮的提取率為0.757%，與回歸模型預(yù)測值（0.766%），較為接近，說明該模型可靠性較高，對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐有一定指導(dǎo)意義?？寡趸钚越Y(jié)果表明，益智總黃酮具有較好的體外抗氧化活性，其清除DPPH 自由基、ABTS 自由基的IC50值分別在0.851～3.188 mg/mL（相當(dāng)于生藥）、0.642～1.789 mg/mL（相當(dāng)于生藥）之間，總抗氧化能力FRAP 值在0.029～0.111 mmol/L 之間，總黃酮含量與清除DPPH 自由基的IC50值和總抗氧化能力FRAP 值呈顯著相關(guān)（P＜0.05），但與清除ABTS 自由基的IC50值相關(guān)性不顯著。研究結(jié)果為藥食同源中藥益智在食品、保健和醫(yī)藥等方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。