李生茂,李倩茹,張馨予,林雪晶,雷 蕾,周春陽
(川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川 南充 637100)
益智為姜科山姜屬植物益智(Alpinia oxyphylla Miq.)的干燥成熟果實(shí),為傳統(tǒng)藥食同源中藥,是海南產(chǎn)道地藥材,也是“四大南藥”之一,具有暖腎固精縮尿,溫脾止瀉攝唾的功效[1]。除藥用外,益智在食品、保健品等領(lǐng)域也應(yīng)用廣泛。早在晉代《南方草木狀》中就有關(guān)于“……嘗以益智粽餉魏武帝”的記載[2]。海南部分地區(qū)也有將益智鮮果腌漬后食用的習(xí)俗,具有治脹氣及腹痛、助消化的作用。近年來,以益智為主料還制成果脯、酒、蜜餞、糖及茶等多種食品或保健品,具有較高的開發(fā)價(jià)值[3-4]。
現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),黃酮類成分是益智重要的活性物質(zhì)之一,具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抑菌等多種藥理活性[5-7]。目前,關(guān)于益智總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究較少,且未見有總黃酮與抗氧化活性相關(guān)性的研究報(bào)道。為了更好地開發(fā)利用益智藥材資源,本文以益智總黃酮提取率為指標(biāo),在單因素試驗(yàn)考察甲醇濃度、超聲時(shí)間及液料比對(duì)益智總黃酮提取率影響的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了其超聲輔助提取工藝,采用DPPH、ABTS 和FRAP 法評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性,并探討了益智總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性。
1.1.1 材料與試劑
1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),由美國Sigma 公司生產(chǎn);2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀,由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn);蘆丁,由四川省維克奇生物科技有限公司生產(chǎn);維生素C,由廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn);甲醇(分析純),由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);水為超純水,實(shí)驗(yàn)室自制;益智,經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李毅主任中藥師鑒定為姜科植物益智(Alpinia oxyphylla Miq.)的干燥成熟果實(shí),樣品S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S10 的產(chǎn)地為海南,樣品S3 的產(chǎn)地為云南,樣品S4 的產(chǎn)地為廣東。
1.1.2 儀器與設(shè)備
Muitiskan Go 全波長酶標(biāo)儀,Mettle AE 240 十萬分之一電子天平,KQ-300DE 型超聲清洗器,N4 紫外分光光度計(jì),TGL-18 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取蘆丁適量,加甲醇配制成濃度為1 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液,備用。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 至10 mL 具塞比色管中,再依次加入4 mL 1%AlCl3溶液,2 mL pH 為5.4 的醋酸-醋酸鈉緩沖液,并加甲醇至10 mL,搖勻,40 ℃水浴靜置20 min,于410 nm 處測定吸光度值[8]。以蘆丁對(duì)照品溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:A=25.102C-0.011 2(R2=0.999 2),蘆丁在0.005~0.03 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
1.2.2 益智總黃酮的提取
取各益智樣品粗粉(過2 號(hào)篩),每份約1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別精密加入一定體積的不同濃度甲醇,稱定質(zhì)量,設(shè)定超聲功率100 W,超聲提取,放冷至室溫,再稱定質(zhì)量,并用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,于7 000 r/min 離心10 min,取上清液,備用。
1.2.3 益智總黃酮提取率的測定
精密吸取益智樣品溶液0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中,按“1.2.1”中的方法測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中總黃酮濃度,并按以下公式計(jì)算總黃酮提取率。
w(%)=(c×V×n)/m×100
式中:w 表示總黃酮提取率(%);c 表示提取液中總黃酮濃度(mg/mL);V 表示提取液體積(mL);n 表示稀釋倍數(shù);m 表示益智樣品取樣量(mg)。
1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.4.1 甲醇濃度對(duì)益智總黃酮提取率的影響
以液料比20∶1(mL/g),采用不同濃度的甲醇(60%、70%、80%、90%和100%)對(duì)益智S10 樣品超聲提取60 min(超聲功率100 W),考察不同濃度甲醇對(duì)益智總黃酮提取率的影響。
1.2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響
固定液料比20∶1(mL/g),采用100%濃度的甲醇對(duì)益智S10 樣品分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min(超聲功率100 W),考察不同超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響。
1.2.4.3 液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響
分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g),采用100%濃度的甲醇對(duì)益智S10 樣品超聲提取60 min(超聲功率100 W),考察不同液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響。
1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以總黃酮提取率為考察指標(biāo)(Y),甲醇濃度、超聲時(shí)間、液料比為自變量(X),采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn),對(duì)益智總黃酮的超聲輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)因素水平見表1。
1.2.6 益智樣品總黃酮含量的測定
精密稱取益智樣品(S1~S10)粗粉,約1 g,按“1.2.5”中確定的最佳提取工藝條件制備樣品溶液,精密吸取0.5 mL 至10 mL 具塞比色管中,按“1.2.3”中的方法測定并計(jì)算總黃酮含量。
式中:c 為提取液中總黃酮濃度(mg/mL);V 為提取液體積(mL);m 為益智樣品取樣量(g)。
1.2.7 益智抗氧化活性的測定
1.2.7.1 DPPH 法測定抗氧化活性
分別取不同濃度供試樣品溶液與230.50 μmol/L DPPH 甲醇溶液各0.15 mL,置于96 孔板中,迅速混勻,40 ℃避光反應(yīng)60 min,于517 nm 處測定吸光度值,設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,按以下公式計(jì)算清除率[9],并以清除率(Y)對(duì)樣品濃度(X)進(jìn)行對(duì)數(shù)回歸,根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50),另取陽性對(duì)照VC 溶液,同法測得其IC50值。
式中:A0為空白吸光度值(即以甲醇代替樣品);Ai為樣品吸光度值。
1.2.7.2 ABTS 法測定抗氧化活性
將濃度為6.83mmol/L 的ABTS 溶液與2.46 mmol/L過硫化鉀溶液等體積混合,室溫暗處靜置12 h,再加蒸餾水稀釋,使其在734 nm 處的吸光值在0.70±0.02左右[10]。精密吸取不同濃度的供試品溶液與ABTS 液各0.15 mL,置于96 孔板中,迅速混勻,40 ℃避光反應(yīng)70 min,于734 nm 處測定吸光度,設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,按以下公式計(jì)算清除率,并以清除率(Y)對(duì)樣品濃度(X)進(jìn)行對(duì)數(shù)回歸,根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50),另取陽性對(duì)VC 溶液,同法測得其IC50值。
式中:A0為空白吸光度值(即以甲醇代替樣品);Ai為樣品吸光度值。
1.2.7.3 FRAP 法測定抗氧化能力
將300 mmol/L 的醋酸緩沖液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ 溶液(用40 mmol/L HCl 配制)、20 mmol/L 的FeCl3溶液按體積比10∶1∶1 的比例混勻,37 ℃保溫30 min,得FRAP 工作液[11]。精密吸取不同濃度的FeSO4·7H2O 溶液5 μL 與TPTZ 工作液150 μL 置于96 孔板中,迅速混勻,30 ℃反應(yīng)5 min,于593 nm 處測定吸光度值。以FeSO4·7H2O 溶液濃度C(mmol/L)對(duì)吸光度值(Y)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=6.464 9C+0.038 4,R2=0.999 0,F(xiàn)eSO4·7H2O 線性范圍為0.006 3~0.187 5 mmol/L。
取益智樣品溶液5 μL 與TPTZ 工作液150 μL置于96 孔板中,迅速混勻,30 ℃反應(yīng)5 min,于593 nm處測定吸光度值,樣品的總抗氧化能力以Fe2+的還原當(dāng)量(mmol/L)表示。另取陽性對(duì)照VC 溶液,同法測定其總抗氧化能力。
1.2.8 數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2016 軟件作圖,Design-Expert 7.1.3.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析,SPSS13.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。
2.1.1 甲醇濃度對(duì)益智總黃酮提取率的影響
如圖1 所示,益智總黃酮提取率隨甲醇濃度的增加而增加,當(dāng)濃度達(dá)到90%時(shí),其提取率增加趨勢相對(duì)變緩,100%甲醇時(shí)提取率達(dá)到最高,這可能與益智中主要的黃酮類化合物多以黃酮類或黃酮醇類苷元(楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山柰素、Kaempferol-7,4'-dimethyl ether、鼠李檸檬素和生松素)的形式存在有關(guān)[7]。
圖1 甲醇濃度對(duì)益智總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of methanol contents on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus
2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響
如圖2 所示,在本試驗(yàn)條件范圍內(nèi),超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響較小,提取率總體隨著超聲時(shí)間的延長有緩慢增加趨勢,在提取30 min 時(shí)提取率達(dá)到最高,此后隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長,總黃酮提取率趨于平穩(wěn)。說明在黃酮含量一定的情況下,在提取一定時(shí)間后,提取液中總黃酮與藥材細(xì)胞中總黃酮濃度已達(dá)到平衡,再延長超聲時(shí)間則浪費(fèi)時(shí)間和能源。
圖2 超聲時(shí)間對(duì)益智總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasound time on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus
2.1.3 液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響
如圖3 所示,隨著提取溶劑用量的增加,益智總黃酮提取率逐漸增加,當(dāng)液料比增加到20∶1(mL/g)時(shí),總黃酮的提取率達(dá)到最大值,而后隨液料比的增加,提取率相對(duì)穩(wěn)定,增幅較小。原因可能是液料比達(dá)到20∶1(mL/g)時(shí),益智樣品中總黃酮幾乎完全被提取,故增加提取溶劑用量后總黃酮提取率增幅也不顯著。
圖3 液料比對(duì)益智總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus
2.2.1 模型的建立與分析
響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface
通過Design-Expert 7.1.3.1 軟件對(duì)表2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合,得到總黃酮提取率(Y)對(duì)甲醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)的回歸模型方程為:Y=-1.828 95+0.036 152A+1.017 5×10-3B+0.030 63C-4.75×10-5AB-1×10-5AC-1.8×10-4BC-1.342 5×10-4A2+1.257 5×10-4B2-4.87×10-4C2。
響應(yīng)曲面圖可更加直觀地反映甲醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)3 個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)益智總黃酮提取率的影響(圖4)。響應(yīng)曲面的陡峭程度與該交互作用的顯著性成正比,曲面越陡峭,說明交互作用越顯著。等高線的橢圓率也可以直觀地反映交互作用的強(qiáng)弱,等高線橢圓率越大,說明該交互作用越顯著[13]。由圖4 可知,AB、BC 及AC 之間交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響均不顯著。
圖4 各因素間的交互作用對(duì)益智總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagrams showing the effects of interactive items on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus
2.2.2 最佳提取工藝條件的確定
通過響應(yīng)面分析確定益智總黃酮最佳提取工藝條件為:甲醇濃度100%,超聲時(shí)間20 min,液料比25∶1(mL/g),該條件下益智總黃酮提取率的理論值為0.766%。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),益智總黃酮平均提取率為0.757%,該結(jié)果與理論值比較接近,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.65%,表明響應(yīng)面模型可靠性較高,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
如表4 所示,10 個(gè)批次益智的總黃酮含量有明顯差異,含量在2.917~7.565 mg/g,最大值是最小值的2.5 倍左右,含量的高低順序依次為:S10>S5>S9>S7>S2>S3>S8>S6>S1>S4,但影響各批次益智總黃酮含量高低的具體原因還有待于進(jìn)一步研究。
表4 10 個(gè)批次益智總黃酮含量Table 4 Total flavonoids contents of AOF 單位:mg/g
2.4.1 清除DPPH 自由基能力
DPPH 自由基是一種人工合成的、比較穩(wěn)定的含氮自由基,常被用來評(píng)價(jià)物質(zhì)的體外抗氧化活性。其甲醇或乙醇溶液呈深紫色,在517 nm 處有強(qiáng)吸收。當(dāng)向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物質(zhì)時(shí),其N 原子上的孤對(duì)電子被配對(duì)而褪色,褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系,因此可以根據(jù)溶液褪色的程度來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。即樣品與DPPH 自由基反應(yīng)后混合溶液顏色越淺,在517 nm 的吸光度越小,樣品清除DPPH 自由基的能力越強(qiáng)[14]。由表5 可知,10個(gè)批次益智樣品對(duì)DPPH 自由基均有較好的清除能力,IC50值在0.851~3.188 mg/mL(相當(dāng)于生藥)之間,但均弱于VC。
2.4.2 清除ABTS 自由基能力
ABTS 二銨鹽經(jīng)過硫酸鉀氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基,在734 nm 處有強(qiáng)吸收。當(dāng)體系中有抗氧化物質(zhì)存在時(shí),ABTS 自由基與之反應(yīng),顏色變淡。因此可以根據(jù)溶液顏色變化的程度來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力[15]。即樣品與ABTS 自由基反應(yīng)后混合溶液顏色越淡,在734 nm 的吸光度值越小,樣品清除ABTS 自由基的能力越強(qiáng)。由表5 可知,10 個(gè)批次益智樣品對(duì)ABTS 自由基均有較好的清除能力,IC50值在0.642~1.789 mg/mL(相當(dāng)于生藥)之間,但均于弱于VC。
表5 10 個(gè)批次益智總黃酮清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和總抗氧化能力Table 5 Total flavonoids contents,DPPH free radical,ABTS free radical scavenging capacities and total antioxidant capacities of AOF
2.4.3 總抗氧化能力
在酸性條件下,F(xiàn)e3+-TPTZ 可被樣品中抗氧化物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ,并呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色,在593 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)體系中的Fe3+-TPTZ 過量時(shí),檢測Fe2+-TPTZ 的生成量可評(píng)價(jià)樣品的還原能力,即總抗氧化能力[16]。由表5 可知,10 個(gè)批次益智樣品均有較好的總抗氧化能力,其FRAP 值在0.029~0.111 mmol/L之間,但均弱于VC。
為進(jìn)一步明確益智抗氧化活性與其總黃酮含量之間的關(guān)系,采用SPSS13.0 軟件Pearson 相關(guān)分析法對(duì)益智中總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)性進(jìn)行了分析。由表6 結(jié)果顯示,益智總黃酮含量與清除DPPH 自由基的IC50值呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為-0.679;總黃酮含量與總抗氧化能力FRAP 值呈顯著正相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.761;總黃酮含量與清除ABTS 自由基IC50值也呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.431,但相關(guān)性不顯著。分析原因,一方面可能是益智中除了富含黃酮類成分外,還存在原兒茶酸、多酚等類抗氧化成分[7,17],其抗氧化作用的發(fā)揮是包括黃酮類成分在內(nèi)的多類成分共同作用的結(jié)果,另一方面也可能是益智黃酮包含有大量黃酮類及黃酮醇類化合物,具有多樣性[7],其與不同自由基的反應(yīng)能力及機(jī)制有所不同。故益智總黃酮的含量與清除DPPH自由基的IC50值和總抗氧化能力FRAP 值具有顯著的相關(guān)性,而與清除ABTS 自由基的IC50值相關(guān)性不顯著,但具體原因還有待于進(jìn)一步研究。
表6 益智總黃酮含量與其抗氧化活性的Pearson 相關(guān)分析Table 6 Pearson correlation analysis of total flavonoids contents and antioxidant activities of AOF
在單因素考察的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)益智總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定益智總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝為:甲醇濃度100%,超聲時(shí)間20 min,液料比25∶1(mL/g),在該條件下益智總黃酮的提取率為0.757%,與回歸模型預(yù)測值(0.766%),較為接近,說明該模型可靠性較高,對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐有一定指導(dǎo)意義??寡趸钚越Y(jié)果表明,益智總黃酮具有較好的體外抗氧化活性,其清除DPPH 自由基、ABTS 自由基的IC50值分別在0.851~3.188 mg/mL(相當(dāng)于生藥)、0.642~1.789 mg/mL(相當(dāng)于生藥)之間,總抗氧化能力FRAP 值在0.029~0.111 mmol/L 之間,總黃酮含量與清除DPPH 自由基的IC50值和總抗氧化能力FRAP 值呈顯著相關(guān)(P<0.05),但與清除ABTS 自由基的IC50值相關(guān)性不顯著。研究結(jié)果為藥食同源中藥益智在食品、保健和醫(yī)藥等方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。