朱海霞

(1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2. 農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站， 青海 西寧 810016；3. 青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016)

雜草對(duì)環(huán)境壓力的響應(yīng)是由基因表達(dá)調(diào)節(jié)介導(dǎo)的。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)體系中，雜草入侵農(nóng)田面臨的主要脅迫是除草劑的應(yīng)用，它觸發(fā)了雜草植物的脅迫響應(yīng)途徑[1]。研究這種現(xiàn)象背后的分子機(jī)制，并為理解基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)，需要分析植物脅迫響應(yīng)途徑中基因的表達(dá)模式?；虮磉_(dá)模式反映了基因活動(dòng)的趨勢(shì)，對(duì)基因功能和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入了解具有重要意義[2-3]。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR)是基因表達(dá)分析中廣泛使用的技術(shù)之一，它提供了比較不同組織和處理中靶基因表達(dá)水平的手段，使研究人員能夠進(jìn)行基因定量分析，還可以驗(yàn)證高通量基因表達(dá)譜[4]。利用RT-qPCR方法在給定的實(shí)驗(yàn)體系中獲得可靠的基因表達(dá)模式，必須消除或降低由于模板的數(shù)量和質(zhì)量、RNA提取量、cDNA合成效率和qPCR擴(kuò)增本身所引起的技術(shù)差異[5]。目前，RT-qPCR數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)先使用內(nèi)參基因作為內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行[6]。由于參與細(xì)胞存活所必需的生理生化過(guò)程，持家基因(House-keeping genes，HKGs)通常以恒定且不受脅迫影響的方式表達(dá)，是RT-qPCR內(nèi)參基因的適宜選擇對(duì)象[5]。將目標(biāo)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)相對(duì)于管家基因(內(nèi)參基因)進(jìn)行歸一化，可以確定目標(biāo)基因的表達(dá)水平是上調(diào)還是下調(diào)。

盡管內(nèi)參基因的表達(dá)水平被認(rèn)為是穩(wěn)定的，但實(shí)際上在不同條件下仍會(huì)發(fā)生變化[7]。之前的研究表明，在低溫脅迫下，番茄(SolanumlycopersicumL.)植株中甘油醛3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)表達(dá)水平增加了30倍，所以該基因不應(yīng)用作涉及溫度變化的番茄基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因[8]。使用內(nèi)參基因而未事先驗(yàn)證其表達(dá)穩(wěn)定性可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)而對(duì)生物學(xué)效應(yīng)做出錯(cuò)誤結(jié)論[9]。因此，使用統(tǒng)計(jì)算法識(shí)別在每個(gè)特定實(shí)驗(yàn)或生物學(xué)環(huán)境中最合適的候選基因已成為qPCR分析的先決條件[5]。

由于大多數(shù)雜草是沒(méi)有相關(guān)基因組資源的物種，只有少數(shù)內(nèi)參基因被學(xué)者用于雜草，且多在雜草植物對(duì)化學(xué)除草劑的響應(yīng)機(jī)制研究中[10-11]，而多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株侵染屬于生物脅迫，野燕麥(AvenafatuaL.)的響應(yīng)機(jī)制有所不同，需要重新驗(yàn)證內(nèi)參基因以進(jìn)行專(zhuān)用于野燕麥響應(yīng)多孢木霉HZ-31菌株的基因表達(dá)分析。因此，在本研究中，采用基于SYBR試劑的RT-qPCR方法鑒定野燕麥中響應(yīng)多孢木霉侵染期間表達(dá)變化最小的內(nèi)參基因。通過(guò)對(duì)植物常用的40個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行初步篩選，最終選擇8個(gè)內(nèi)部參照基因作為候選內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)估，包括18S核糖體RNA(18SrRNA)，28S核糖體RNA(28SrRNA)，α-微管蛋白(TUA)，泛素結(jié)合酶(UBC)和肌動(dòng)蛋白(ACTin)，甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，TATA結(jié)合蛋白(TBP)，翻譯延伸因子(EF-1α)[5,12]。通過(guò)4種不同的統(tǒng)計(jì)算法評(píng)估了這些基因的表達(dá)穩(wěn)定性，以選擇最合適的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株 多孢木霉HZ-31菌株分離于自然感病的大刺兒菜(Cirsiumarvense(L.) Scop.)，由青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室提供保存。

1.1.2供試材料 兩組野燕麥苗樣品，處理組為多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液處理，對(duì)照組為清水處理。

1.1.3供試試劑(試劑盒) 液氮，RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit，TIANGEN)，基因組DNA污染的去除和第一鏈cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)，RT-qPCR試劑盒(SYBRTMPremix Dimer EraserTM，TaKaRa)。

1.1.4供試儀器 高速冷凍離心機(jī)(5804R，Eppendorf，德國(guó))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler96，Roche，瑞士)，超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000，Thermo Scientific，美國(guó))，-86℃超低溫保存箱(DW-86L828 J，海爾，中國(guó))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1野燕麥樣品制備 種子經(jīng)消毒、催芽后，選露白一致的播種在塑料花盆中(直徑15 cm)中，每盆播30粒，共18盆，澆足水后置溫室培養(yǎng)，常規(guī)管理。溫室晝/夜溫度為(25±1)℃/(20±1)℃，相對(duì)濕度為65%～75%，光照強(qiáng)度為600～800 μmol·m-2·s-1。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至8～10 cm時(shí)，隨機(jī)分成2組，一組進(jìn)行HZ-31發(fā)酵液噴施處理，孢子濃度為108個(gè)·mL-1每盆均勻噴灑25 mL，另一組噴施等量清水。分別在處理前、處理后3 d和6 d時(shí)，對(duì)各處理進(jìn)行地上部樣品采集，并迅速在液氮中冷凍后保存于—80℃冰箱中備用。每種處理類(lèi)型和處理時(shí)間下3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2總RNA提取和第一鏈cDNA合成 根據(jù)試劑盒說(shuō)明，使用RNA simple Total RNA Kit從野燕麥樣品中分離出總RNA。用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度，保留A260/A280比值在1.8～2.2之間，A260/A230比值在2.0～2.6之間的樣品。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA污染的去除，將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3候選內(nèi)參基因及引物 為篩選適宜野燕麥基因表達(dá)定量PCR研究的內(nèi)參基因，在ICG(http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page)[13]網(wǎng)站上挑取植物常用的40個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行初步篩選，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果特異性和擴(kuò)增條件一致性，最終確定8個(gè)常用的管家基因作為候選基因，包括18S ribosomal RNA(18S)，28S ribosomal RNA(28S)，Tubulin alpha(TUA)，Ubiquitin-conjugating enzyme(UBC)，Actin(ACT)，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)，TATA-binding protein(TBP)和Elongation factor(EF-1α)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 候選內(nèi)參基因及引物序列Table 1 Candidate reference genes and primer sequences

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR分析 使用SYBR?Premix Dimer EraserTM在Roche LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR機(jī)上進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)混合物包含2 μL cDNA模板，10 μL 2×SYBR?Premix DimerEraser，上下游引物各0.8 μL(10 μM)和6.4 μLddH2O。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；然后在95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線是通過(guò)將擴(kuò)增溫度從60℃升至95℃產(chǎn)生，每個(gè)循環(huán)溫度升高0.5℃。設(shè)置無(wú)模板對(duì)照，每個(gè)樣品的RT-qPCR分析含3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5候選基因表達(dá)穩(wěn)定性分析 使用GeNorm[14-15]，NormFinder[15-16]，BestKeeper[17-18]和RefFinder[19-20]4個(gè)程序分析8個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。引物特異性利用RT-qPCR熔解曲線測(cè)定中存在單個(gè)峰來(lái)驗(yàn)證。使用LinRegPCR軟件[21]測(cè)量各內(nèi)參基因的RT-qPCR擴(kuò)增效率。引物擴(kuò)增效率(E)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(slope)相關(guān)，由公式E=(10-1/slope-1)×100，計(jì)算得出引物的擴(kuò)增效率。理論上最佳值為100%，表明模板以指數(shù)方式復(fù)制，可接受范圍通常為90%至110%[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孢木霉HZ-31菌株侵染野燕麥變化

多孢木霉HZ-31菌株處理前、處理后3 d和6 d時(shí)，即野燕麥無(wú)癥狀、出現(xiàn)萎蔫、整株枯死(圖1)。

圖1 接種多孢木霉HZ-31菌株后野燕麥癥狀表現(xiàn)Fig. 1 Symptoms of A. fatua inoculated by T. polysporum HZ-31注：A為接種后0 d；B為接種后3 d；C為接種后6 dNote:A,0 day after inoculation；B,3 days after inoculation；C,6 days after inoculation

2.2 引物性能分析

從定量分析獲得的解鏈結(jié)果表明，未觀察到引物二聚體和額外的條帶，并形成了單峰圖。單峰熔解曲線證實(shí)了所研究基因不存在引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增效率檢測(cè)結(jié)果顯示，這8個(gè)基因的PCR效率在93%(ACT)到109%(GAPDH)之間(表1)。

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平變異

Cq值表征mRNA轉(zhuǎn)錄水平，用來(lái)反映基因的表達(dá)豐度。RT-qPCR分析產(chǎn)生的Cq值可用于檢測(cè)8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平。表2列出了每個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平。在不同處理及處理時(shí)間下，所有候選內(nèi)參基因的Cq值范圍為12.7至28.1。28S的表達(dá)水平最高，平均Cq值為12.8，而TUA的表達(dá)水平最低，平均Cq為25.8(表2)。變異系數(shù)(CV)顯示各處理內(nèi)測(cè)量值的變異程度(較低的值表示較低的變異性)。在所有處理及處理時(shí)間下，18S變異性最低，CV值為2.6%，而EF-1α變異性最大，CV值為11.2%。

2.4 GeNorm分析

GeNorm程序利用M值評(píng)估8個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。M值為某一基因相對(duì)于所有其他基因的平均變異。在GeNorm程序中，確定基因穩(wěn)定性的閾值設(shè)置為M <1.5，M值越低表明候選基因穩(wěn)定性越高[14]。圖2為基于GeNorm分析候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性M值?？梢钥闯?，本試驗(yàn)條件下，多數(shù)候選基因M值均小于1.5，說(shuō)明8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性均較好。具有相同M值的28S和TBP是野燕麥正常生長(zhǎng)時(shí)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而GAPDH和TBP時(shí)是多孢木霉HZ-31發(fā)酵濾液處理3 d后野燕麥地上部組織的最穩(wěn)定內(nèi)參基因。18S和28S是多孢木霉HZ-31發(fā)酵濾液處理6 d后野燕麥地上部組織的最穩(wěn)定內(nèi)參基因，同時(shí)也是包括所有處理樣本(Total)的最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在大多數(shù)樣品中，EF-1α和TUA被確定為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

圖2 基于GeNorm分析候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性Fig.2 Analysis of average expression stability of candidate reference genes based on GeNorm注：Total為將所有處理的樣本合并，下同Note:total is to merge all processed samples,the same as below

為確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)量，通過(guò)GeNorm程序采用基于不同基因表達(dá)穩(wěn)定性的排列順序歸一化因子NFn和NFn+1，計(jì)算不同候選基因的成對(duì)變化值Vn/Vn+1值，確定增加內(nèi)參基因數(shù)量是否可提高標(biāo)準(zhǔn)化因子的穩(wěn)定性。通常采用0.15(Vn值)為終止值[14]。圖3為基于GeNorm的不同處理下最佳內(nèi)參數(shù)量分析。多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液處理第0，3，6 d和所有處理樣本(Total)的V2/3分別為0.131，0.116，0.128和0.090，均低于0.15(圖3)，表明兩個(gè)內(nèi)參基因?qū)τ谶@些樣品的準(zhǔn)確歸一化是足夠的。而多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液處理第0，3，6 d和所有處理樣本(Total)的V3/4則有所差異，第0 d和所有處理樣本(Total)的V3/4分別為0.176和0.189，均大于1.5；第3和6 d的V3/4分別為0.090和0.103，均小于1.5，其V4/5均大于1.5(0.284和0.177)。

為了從數(shù)學(xué)上對(duì)狼的社會(huì)等級(jí)進(jìn)行建模,在設(shè)計(jì)GWO時(shí),將最佳的解決方案視為alpha(α),因此,第2個(gè)和第3個(gè)最佳解決方案被分別視為beta(β)和delta(δ),剩下的候選方案視為omega(ω),在GWO算法中狩獵(優(yōu)化)是由α、β和δ引導(dǎo)的,ω跟隨其他3種狼。

圖3 基于GeNorm的不同處理下最佳內(nèi)參數(shù)量分析Fig.3 Analysis of optimal internal parameters under different processing conditions based on GeNorm

2.5 NormFinder分析

利用NormFinder程序計(jì)算了8個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值，值越低表明穩(wěn)定性越高(表3)?？梢钥闯觯刑幚順颖?Total)的3個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁BC(0.100)，GAPDH(0.100)和ACT(0.338)。TUA和UBC是0 d時(shí)樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的基因，而EF-1α是樣品中表達(dá)穩(wěn)定性最低的內(nèi)參基因。UBC和GAPDH是處理3 d后樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；與GeNorm數(shù)據(jù)一致，EF-1α是處理3 d后樣品中表達(dá)穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因。GAPDH和ACT是處理6 d后樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的基因。

表3 基于NormFinder分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性Table 3 stability analysis of candidate reference genes based on NormFinder

但是，在大多數(shù)樣品中，由NormFinder生成的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性等級(jí)與GeNorm的等級(jí)有所不同。例如，在GeNorm分析中，18S和28S被確定為所有處理樣本(Total)中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在NormFinder分析中，它們的穩(wěn)定性分別排名第6和第5。

2.6 BestKeeper分析

基于Cq值利用BestKeeper程序?qū)?個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，并計(jì)算所有候選參考基因的變異系數(shù)(CV)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。SD <1的數(shù)據(jù)視為可接受的變異范圍，CV和SD值越高表示基因表達(dá)穩(wěn)定性越低[18]。表4為BestKeeper分析結(jié)果。在本試驗(yàn)條件下，18S是多孢木霉HZ-31發(fā)酵液處理第0，6 d和所有處理樣本(Total)中表達(dá)最穩(wěn)定的基因，而處理第3 d樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的基因?yàn)?8S，其標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1(SD< 1)。GAPDH在第3 d樣品中表達(dá)穩(wěn)定性排第2，但在第0，6 d和所有處理樣本(Total)中排名靠后。EF-1α和TUA在大多數(shù)樣本中被評(píng)為表達(dá)最不穩(wěn)定的基因，除0 d時(shí)TUA標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98外，二者標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于1(SD> 1)。同樣，對(duì)于大多數(shù)樣品，用BestKeeper生成的候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性與GeNorm和NormFinder的結(jié)果不一致。

表4 基于BestKeeper分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(CV±SD)Table 4 Stability of candidate reference genes based on BestKeeper analysis (CV±SD)

2.7 RefFinder分析

通過(guò)RefFinder程序確定候選內(nèi)參基因的綜合排名(表5)。RefFinder程序集成了包括GeNorm，NormFinder，BestKeeper和ΔCt評(píng)估法在內(nèi)的4種分析程序。結(jié)果表明，TBP是多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液處理第0和3 d時(shí)野燕麥樣品基因表達(dá)分析的適宜內(nèi)參基因，18S為處理第6 d時(shí)的適宜內(nèi)參基因，UBC為所有處理樣本綜合(Total)中最適宜的內(nèi)參基因。在各處理?xiàng)l件下，EF-1α和TUA是表達(dá)最不穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因。

表5 基于RefFinder分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性Table 5 Stability analysis of candidate reference genes based on reffinder

使用多個(gè)內(nèi)參基因可以有效降低試驗(yàn)誤差，在本試驗(yàn)條件下，多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵濾液處理第0，3，6 d和所有處理樣本綜合(Total)中兩個(gè)適宜內(nèi)參基因的組合分別為T(mén)BP和TUA，TBP和GAPDH，18S和TBP，UBC和18S。

3 討論

野燕麥(AvenafatuaL.)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)且經(jīng)濟(jì)危害較大的雜草類(lèi)物種之一[23,24]，具有高競(jìng)爭(zhēng)力、對(duì)多種除草劑的抵抗力、模仿作物(類(lèi)似物候?qū)W)和擁有不同的發(fā)芽策略等特征，極難除盡[24]。木霉菌是重要的生防菌種，前期篩選出的多孢木霉HZ-31菌株對(duì)野燕麥具有較好的防效。為了明確木霉的生物防治機(jī)理，本研究以接種多孢木霉HZ-31菌株的野燕麥樣本中8種候選內(nèi)參基因作為候選基因，通過(guò)RT-PCR和軟件分析篩選出了在多孢木霉侵染條件下合適的野燕麥內(nèi)參基因，為分析雜草對(duì)木霉菌的生物脅迫響應(yīng)機(jī)制，研究響應(yīng)途徑中基因的表達(dá)模式提供依據(jù)。

RT-qPCR是基因表達(dá)定量分析中廣泛使用的技術(shù)之一。利用RT-qPCR分析基因表達(dá)模式必須對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以減輕技術(shù)和操作帶來(lái)的影響，常通過(guò)內(nèi)源參考基因的歸一化來(lái)實(shí)現(xiàn)[5,25-26]。本研究選用8種候選內(nèi)參基因(18S,28S,TUA,UBC,ACT,GAPDH,TBP和EF-1α)進(jìn)行了基于SYBR Green的RT-qPCR分析。良好的內(nèi)參基因的表達(dá)應(yīng)不受試驗(yàn)條件的影響，在所有細(xì)胞中表達(dá)水平穩(wěn)定。但一些內(nèi)參基因是受到調(diào)節(jié)和變化的，不同組織樣本中，最佳內(nèi)參基因會(huì)有所不同[27-29]。

GeNorm,NormFinder和BestKeeper是基于統(tǒng)計(jì)分析的3個(gè)程序，研究人員常用來(lái)分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性[19-20]。NormFinder的操作原理與GeNorm程序相似，但是后者可以選擇合適的參考基因組合和最佳參考基因數(shù)量。與GeNorm和NormFinder相比，BestKeeper程序可以分析參考基因和靶基因的穩(wěn)定性。在本研究中，GeNorm和NormFinder的分析結(jié)果是相似的，而與BestKeeper的結(jié)果差異較大。前人也報(bào)道了BestKeeper與其他方法之間的不同之處[30]。在幾項(xiàng)研究中，通過(guò)基于多種評(píng)價(jià)方法排序的幾何平均值，解決了不同方法之間的分歧的問(wèn)題，包括基于Web的工具RefFinder[24,31-32]和通過(guò)加權(quán)聚合的R包RankAggreg提供的交叉熵算法[33]。因此，本研究使用4個(gè)程序(GeNorm，NormFinder，BestKeeper和RefFinder)選擇野燕麥的內(nèi)參基因，類(lèi)似方法已在許多物種研究中使用[34-35]。

通過(guò)4個(gè)軟件的評(píng)估，TBP，18S和UBC是木霉侵染時(shí)野燕麥中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，EF-1α和TUA是表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因，這與前人的研究有類(lèi)似之處[36-37]。TBP基因是TATA盒結(jié)合蛋白，在細(xì)胞和組織中具有較高活性，在大多數(shù)基因的活性調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。UBC是使用較多的內(nèi)參基因，報(bào)道顯示其具有較高的表達(dá)穩(wěn)定性，是擬南芥和番茄種子中唯一的穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因[38]。在用除草劑處理過(guò)的抗除草劑的野燕麥種群中，GAPDH基因也被認(rèn)為是最穩(wěn)定的基因之一[24]。相比之下，本研究中GAPDH表達(dá)相對(duì)不穩(wěn)定，與GAPDH基因表達(dá)穩(wěn)定性的報(bào)道存在分歧。例如，GAPDH被推薦為桐樹(shù)種子發(fā)育過(guò)程中的合適參考基因[39]，但大戟屬的結(jié)果表明，GAPDH1和GAPDH2的轉(zhuǎn)錄本水平在芽、種子和各種器官中非常不穩(wěn)定[40]。這說(shuō)明不同物種之間甚至同一物種內(nèi)的這種對(duì)比結(jié)果不一定歸因于對(duì)不同處理的差異表達(dá)，也可能是由不同研究引物的異質(zhì)性引起的，這些異質(zhì)性可能會(huì)擴(kuò)增不同物種的成員，從而呈現(xiàn)差異表達(dá)譜。

Xu等人[41]在研究Alopecurusjaponicus響應(yīng)除草劑的內(nèi)參基因穩(wěn)定性后發(fā)現(xiàn)，根中的EF1和UBQ，莖中的EF1，TUB，CAP和18S以及葉片中的GAPDH和18S可作為qPCR歸一化的內(nèi)參基因。EF-1α基因在某些生物脅迫下的雜草植物中作為不穩(wěn)定表達(dá)參考基因被報(bào)道[29,42]。而Petit等[11]在對(duì)11種參考基因在除草劑處理中的穩(wěn)定性表達(dá)進(jìn)行的研究中指出EF-1α和18S是基因研究中表達(dá)最少的穩(wěn)定基因，可見(jiàn)參考基因的穩(wěn)定性也會(huì)因?yàn)槲锓N不同而發(fā)生改變。本研究中參考基因會(huì)在實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)生變化，GAPDH在多孢木霉HZ-31菌株處理野燕麥后第3 d具有較好的穩(wěn)定性，但在其他時(shí)間下穩(wěn)定性排名靠后，因此必須針對(duì)每種特定應(yīng)用驗(yàn)證候選參考基因，對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行全面驗(yàn)證。

在最佳參考基因數(shù)量上，本研究中，通過(guò)GeNorm分析發(fā)現(xiàn)第3和6 d的V3/4均小于1.5，且比V2/3更小，這表明可能需要3個(gè)基因(GAPDH,TBP和28S或18S,28S和TBP)才能有效地標(biāo)準(zhǔn)化第3和6 d的樣品。但是，不應(yīng)將1.5作為終止值的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，有研究發(fā)現(xiàn)Vn/Vn+1的終止值更高[15,35,38]。Robledo等[43]批評(píng)利用沒(méi)有生物學(xué)意義的排名而選擇最佳內(nèi)參基因的行為，建議如果4種方法不同，則由NormFinder提供的參考基因得到BestKeeper的描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的支持(SD，CV和r)為判定依據(jù)。Kozera和Rapacz[5]建議使用至少一對(duì)負(fù)責(zé)功能差異較大的基因，因?yàn)橥瑫r(shí)調(diào)節(jié)它們表達(dá)的概率較小。其他人建議至少使用3個(gè)參考基因以獲得最佳結(jié)果[44-45]。

4 結(jié)論

本研究利用GeNorm，NormFinder，BestKeeper和RefFinde 4個(gè)程序分析出TBP,18S和UBC是木霉侵染時(shí)野燕麥中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，TBP和TUA，18S和TBP，UBC和18S為最適宜兩內(nèi)參基因組合，綜合評(píng)估了接種多孢木霉HZ-31菌株的野燕麥樣本內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，構(gòu)建了適宜野燕麥響應(yīng)多孢木霉HZ-31菌株接種后樣本基因表達(dá)的RT-qPCR技術(shù)體系，為多孢木霉HZ-31菌株侵染下功能基因的表達(dá)分析及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，也有助于深入研究多孢木霉HZ-31菌株和野燕麥基因之間的互作關(guān)系。