康星凱，盧文勇，蔡慧欣，楊文軍

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 32500）

肝細胞癌（HCC）是全球最常見的癌癥之一，復發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，患者的生存率低[1-2]。HCC的高病死率與缺乏早期診斷的相應指標有關(guān)，往往在診斷出HCC時患者多已經(jīng)到了中晚期，并已發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。因此，尋找HCC早期診斷及治療的標志物具有很大意義。人孕激素和脂聯(lián)素受體（progestin and adipoQ receptor，PAQR）家族目前已發(fā)現(xiàn)的成員有11個，被命名為PAQR 1至11。近來研究已發(fā)現(xiàn)，PAQR4 在乳腺癌[4]、胃癌[5]、非小細胞肺癌[6-7]中上調(diào)，促使疾病進展、提示預后不良。然而目前有關(guān)PAQR4在HCC中的表達和作用機制仍不清楚。本研究擬通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析PAQR4在HCC組織中的表達，并通過實驗研究敲低PAQR4后分析肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移情況，探討PAQR4在HCC中產(chǎn)生作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 生物信息分析

本研究采用的基因表達數(shù)據(jù)和臨床資料來源于TCGA數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih.gov/）。臨床病理資料包括患者的年齡、性別、家族癌癥史等信息。

1.2 細胞培養(yǎng)

本實驗使用了兩種HCC細胞系Hep3B和Huh-7，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。Hep3B細胞在添加丙酮酸鈉、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。Huh7 細胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中，并視細胞的生長情況及時對細胞進行傳代。

1.3 轉(zhuǎn)染

使用兩種siRNA下調(diào)Hep3B和Huh7 中PAQR4的表達，由吉瑪基因公司合成。siPAQR4-1 序列：5’-AGGCUCCGUGCUCUAUCACTT-3’，5’-GUGAU AGAGCACGGAGCCUGC-3’；siPAQR4-2序列：5’-U CUUGCUCUGAGAGUUCAATT-3’，5’-UUGAACUC UCAGAGCAAGACG-3’。使用Lipofectamine2000（Life Technologies）將siPAQR4-1、siPAQR4-2和對照siRNA轉(zhuǎn)染到Hep3B和huh7中，后續(xù)根據(jù)操作說明完成。將待處理細胞在6孔板中進行鋪板，貼壁過夜后，待細胞達到60%左右，進行siRNA轉(zhuǎn)染實驗，（單轉(zhuǎn)，終濃度為10 nmol/L siRNA），對照組轉(zhuǎn)入等量對照siRNA，對照siRNA為和目的基因的序列沒有同源性的普通陰性對照的siRNA，并于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后換回原培養(yǎng)基。

1.4 PAQR4表達水平檢測

使用Trizol法，根據(jù)操作說明提取RNA，并使用分光光度計測量OD260、OD280數(shù)值，估算提取到的RNA的濃度及質(zhì)量。根據(jù)TaKaRa公司說明書嚴格進行逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈（RT-PCR）反應。每組3個復孔，以GAPDH為內(nèi)參，使用伯樂（Bio-Rad）實時定量PCR儀器檢測。所用的引物序列為：PAQR4（F-5’-CGAACTGGGCAACATCTACA-3’；R-5’-AGGG TGTTGACAAGGCAGAC-3’），GAPDH（F-5’-GCAA ATTCCATGGCACCGTC-3’；R-5’-CCTGGAAGATG GTGATGGGA-3’），PAQR4的相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5 PAQR4蛋白表達水平檢測

采用Western blotting法。對Hep3B和Huh7進行轉(zhuǎn)染操作后換回原培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，進行提蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶中封閉1 h后，使用PAQR4抗體（13401-1-AP，proteintech）和GAPDH抗體（2118S，Cell Signaling Technology）作為一抗孵育，抗體均以1:1 000進行稀釋，4 ℃搖床過夜，PBS洗膜3次后，用辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜3 次后再用ECL plus試劑進行曝光，觀察。

1.6 細胞增殖能力檢測

采用MTS法。本研究使用MTS試劑盒（Promega）進行細胞增殖實驗。使用96孔板，加入100 μL培養(yǎng)基。Hep3B和Huh7均為2 000個細胞/孔。在培養(yǎng)0、24、48 h后96孔板內(nèi)分別加入20 μL的MTS溶液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后使用多功能酶標儀對各孔在570 nm波長下的OD值進行測量。然后依據(jù)所測到OD值數(shù)據(jù)繪制出細胞的增殖曲線。

1.7 細胞遷移和侵襲能力檢測

Transwell小室進行遷移和侵襲實驗，本研究使用的為24孔板，培養(yǎng)孔中放置8 μm孔徑的普通（用于評估遷移）或基質(zhì)凝膠涂層（用于評估侵襲）的transwell插入物（Costar）。

下室中加入500 μL DMEM（含10%胎牛血清）。Hep3B或huh7細胞轉(zhuǎn)染24 h后，用PBS洗滌2次，重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基（2×104個/孔）中，加入上室。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，將遷移到下室的細胞在多聚甲醛中進行20 min的固定，再使用20%乙醇0.01%結(jié)晶紫溶液對細胞進行染色。10 min后，使用棉簽手動擦拭過濾器頂部未遷移的細胞。然后進行拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理與分析，計量資料采用（）表示，兩組比較采用獨立樣本的t檢驗。組間比較采用Pearson卡方檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析。采用Pearson卡方檢驗進行PAQR4 表達與免疫細胞相關(guān)性分析。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PAQR4在HCC組織中表達上調(diào)

首先從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載369 例HCC組織和50例癌旁組織的PAQR4 mRNA表達水平相關(guān)數(shù)據(jù)。分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織中PAQR4 mRNA水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1A）。

進一步在TCGA數(shù)據(jù)庫中收集基因表達數(shù)據(jù)。生存分析顯示，HCC患者組織中PAQR4高表達患者較PAQR4 低表達患者生存生存期短（P=0.0014）（圖1B）。進一步分析兩組臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達與年齡、家族癌癥史、腫瘤組織學分級、TNM分期存在相關(guān)性，提示PAQR4高表達可能與這些因素有關(guān)（表1）。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中350例HCC患者PAQR4低表達組與高表達臨床病理特征比較

圖1 PAQR4在HCC組織中的表達比較（A）及PAQR4與HCC預后的相關(guān)性（B）

2.2 PAQR4調(diào)控HCC的細胞增殖能力

將兩種不同的siRNA 轉(zhuǎn)染到Hep3B 細胞和Huh7 細胞中，通過PCR檢測PAQR4 RNA，觀察肝癌細胞中PAQR4 的表達情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染si-PAQR4-1、siPAQR4-2、siCon后Hep3b細胞中PAQR4的表達量分別為（0.714±0.076）、（0.492±0.157）、（1.001±0.001），差異具有統(tǒng)計學意義（圖2A，P＜0.05）；Huh7 細胞中PAQR4 的RNA表達量分別為（0.477±0.155）、（0.304±0.107）、（1.001±0.000），差異具有統(tǒng)計學意義（圖2B，P＜0.05）。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后HCC細胞系Hep3B（A）和Huh7（B）中PAQR4的RNA表達量（*P＜0.05）

研究通過Western blotting檢測Hep3B和Huh7中PAQR4 的蛋白表達量（圖3），分析發(fā)現(xiàn)，敲低后PAQR4的表達量確實降低，表明本實驗采用的敲低PAQR4模型可用于后續(xù)的研究。

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA后HCC細胞系Hep3B（A）和Huh7（B）中PAQR4的蛋白表達量

MTS細胞增殖能力檢測結(jié)果表明，敲低PAQR4后細胞的吸光度值低于陰性對照，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4），這提示敲低PAQR4 會導致Hep3b和Huh7細胞的增殖能力減弱。

圖4 HCC細胞系Hep3B（A）和Huh7（B）細胞增殖情況

2.3 PAQR4調(diào)控HCC的細胞侵襲和遷移能力

用Transwell實驗分析敲低PAQR4 后HCC的細胞侵襲和遷移能力，結(jié)果表明，PAQR4在Hep3B和Huh7細胞中的表達下調(diào)導致細胞侵襲和遷移能力下降，穿過小室的細胞數(shù)量少于陰性對照組（圖5）。

2.4 PAQR4表達與免疫細胞相關(guān)

免疫系統(tǒng)細胞浸潤腫瘤，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。Bindea[8]報道免疫細胞類型的特征基因集。因此，本研究評估了PAQR4的表達是否與HCC組織中的免疫細胞浸潤有關(guān)，通過計算免疫細胞的特征基因集，利用GSVA（R包）的ssGSEA算法[9]分析HCC中這些免疫細胞類型的相對數(shù)量，以TPM值計算mRNA表達量。mRNA表達的標準化值以log2轉(zhuǎn)化值表示。通過TCGA GDC門戶網(wǎng)站（http://portal.gdc.cancer.gov/），獲取HCCmRNA表達數(shù)據(jù)，然后計算PAQR4表達與免疫細胞浸潤的Pearson相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達與HCC組織中中性粒細胞、樹突狀細胞、細胞毒性細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、T輔助型17（Th17）細胞、B細胞、未成熟樹突狀細胞、T細胞、CD8 T細胞、漿細胞樣樹突狀細胞等免疫細胞浸潤呈負相關(guān)，而與T輔助型2（Th2）細胞、效應記憶性T細胞、NK細胞、濾泡輔助性T細胞、CD56bright NK細胞的浸潤呈正相關(guān)（圖6、表2）。

表2 PAQR4表達與不同免疫細胞浸潤的相關(guān)性分析

圖6 PAQR4表達與不同免疫細胞浸潤的關(guān)系

3 討論

當前，HCC的治療方法首選手術(shù)，但中晚期肝癌往往已經(jīng)出現(xiàn)癌灶轉(zhuǎn)移，治療效果受限。肝移植也仍存在疾病復發(fā)等局限性。因此，尋找有效的肝癌治療策略迫在眉睫[10-11]。

PAQR4屬于PAQR家族，該家族在2005年首次被發(fā)現(xiàn)，具有7個跨膜拓撲結(jié)構(gòu)域[12]。2017年Wang等[13]發(fā)現(xiàn)PAQR4 在細胞增殖中起著至關(guān)重要的作用。已有的研究表明，PAQR4可在多種癌癥中高表達，并對癌癥進展起到重要的作用。在乳腺癌中，PAQR4能夠通過抑制CDK4的降解和泛素化，起到促腫瘤的效果[4]。在前列腺癌中，敲低PAQR4 能夠抑制癌增殖、遷移、侵襲，還能夠抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[14]。但截止目前，PAQR4在HCC中的表達與機制尚不清楚，需要進一步探討。

本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，與正常的肝組織進行相比，PAQR4在肝癌組織中的表達上調(diào)；臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達與年齡、腫瘤組織學分級、TNM分期有關(guān)，這說明PAQR4對肝癌發(fā)生和進展具有促進作用。因此，PAQR4有望成為判斷肝癌的一個新的生物標記物以及治療靶點。PAQR高表達與肝癌患者預后較差存在著相關(guān)性，因而PAQR4可能成為一個潛在的預后指標。本研究通過siRNA敲低PAQR4導致HCC細胞系Hep3B和Huh7中的細胞增殖、侵襲和遷移能力遭到抑制，這進一步證實PAQR4在肝癌中的促進作用，也與其他文獻中的PAQR4可促癌的結(jié)論一致。因此，我們的研究結(jié)果有助于進一步明確肝癌發(fā)生發(fā)展的機制。

近年來，car-t細胞療法、免疫檢查點抑制劑療法等免疫治療策略成為熱點[15]。肝臟是重要的免疫器官。腫瘤微環(huán)境中免疫細胞組成和比例的變化對腫瘤的發(fā)展也起著至關(guān)重要的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達與肝癌組織中中性粒細胞、樹突狀細胞、細胞毒性細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、T輔助型17（Th17）細胞、B細胞、未成熟樹突狀細胞、T細胞、CD8 T細胞、漿細胞樣樹突狀細胞等免疫細胞浸潤呈負相關(guān)，而與t輔助型2（Th2）細胞、效應記憶性T細胞、NK細胞、濾泡輔助性T細胞、CD56bright NK細胞的浸潤呈正相關(guān)。PAQR4可能會影響這些免疫細胞的數(shù)量，從而最終改變各種細胞分泌物的多少，改變腫瘤的微環(huán)境。在未來我們需要進一步明確為何PAQR4導致了免疫環(huán)境的這種變化，及其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的機制，這將會有助于我們制定靶向免疫治療策略，為今后肝癌的治療提供新的途徑。