王艷芬，張雅倫，舒相華，張瑩，張雅靖，王余磊，呂濤，張智慧，潘瓊，黃鑫，董燕，宋春蓮*

(1.蒙自市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 蒙自 661199； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201； 3.昆明市豬病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；4.昆明市動(dòng)物疫病防控技術(shù)科技創(chuàng)新中心，云南 昆明 650201)

狂犬病(Rabies)俗稱(chēng)“瘋狗病”“恐水癥”，是由狂犬病病毒引起的一種以侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)為特征的高度致死性的人獸共患傳染病，我國(guó)將其歸于二類(lèi)動(dòng)物疫病，是迄今為止唯一病死率達(dá) 100%的急性傳染病。狂犬病毒外形呈彈狀，內(nèi)含有單鏈RNA，病毒顆粒長(zhǎng)130～240nm，直徑65～80 nm[1]?？袢〔《疽妆蝗展狻⒆贤饩€(xiàn)、甲醛、新潔爾滅、50%～70%酒精等滅活。人主要是通過(guò)直接接觸感染，大多是被攜帶狂犬病毒的動(dòng)物抓傷、咬傷或舔舐傷口處，或者狂犬病患病動(dòng)物唾液和組織液直接接觸傷口發(fā)生感染。也能夠通過(guò)吸入氣溶膠而感染[2]。臨床表現(xiàn)以恐水、畏光、吞咽困難、流涎、狂躁等為主要特征。當(dāng)前，仍然沒(méi)有有效藥物和療法治療狂犬病[3]，暴露前或暴露后接種狂犬疫苗是唯一有效的預(yù)防手段[4]，在被患狂犬病動(dòng)物或疑似患狂犬病動(dòng)物咬傷、舔舐后，應(yīng)立即用流水、肥皂水沖洗傷口，并及時(shí)注射狂犬病疫苗，降低狂犬病的發(fā)病率?？袢〉陌l(fā)病過(guò)程可分為3個(gè)階段：一是局部組織內(nèi)繁殖期；二是侵入中樞神經(jīng)期；三是向各器官擴(kuò)散期。狂犬病發(fā)生不分季節(jié)，一年四季都可能發(fā)生，在我國(guó)，狂犬病發(fā)生集中在夏秋兩季[2]，居全球第二，僅次于印度。有資料表明，狂犬病病毒主要由蝙蝠傳播[5]，而犬是人和動(dòng)物間傳播狂犬病病毒的主要連接對(duì)象。我國(guó)狂犬病的流行，自20世紀(jì)50年代以來(lái)出現(xiàn)過(guò)3次高峰[6]，由此可見(jiàn)，我國(guó)狂犬病疫情依然比較嚴(yán)重，而且狂犬病疫區(qū)在我國(guó)呈不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，全國(guó)已有28個(gè)省市報(bào)告過(guò)狂犬病。為了防止狂犬病的發(fā)生和傳播，對(duì)易感動(dòng)物進(jìn)行狂犬病疫苗免疫預(yù)防是一項(xiàng)至關(guān)重要的工作。

目前，關(guān)于狂犬病抗體檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光法、快速熒光灶抑制試驗(yàn)、膠體金免疫層析技術(shù)等?？袢】乖瓩z測(cè)技術(shù)主要有熒光抗體試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)、原位雜交法、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基因芯片技術(shù)等。抗體檢測(cè)中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，抗原檢測(cè)中熒光RT-PCR方法具有較高的特異性和靈敏度。本次檢測(cè)采用ELISA和熒光RT-PCR方法完成檢測(cè)，通過(guò)此次檢測(cè)，能夠?yàn)槊勺允?個(gè)街道(鄉(xiāng)、鎮(zhèn))狂犬病的防控工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

材料來(lái)源于2011—2020年蒙自市7個(gè)街道(鄉(xiāng)、鎮(zhèn))(文瀾街道、草壩鎮(zhèn)、雨過(guò)鋪街道、新安鎮(zhèn)、冷泉鎮(zhèn)、西北勒鄉(xiāng)、期路白鄉(xiāng))，經(jīng)“春季或秋季集中免疫加日常補(bǔ)免”程序免疫狂犬病疫苗的犬只,犬血清和唾液棉拭子分別為282份和124份。

1.2 采樣方法及保存

參照《動(dòng)物狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)技術(shù)》(GB/T 34739—2017)，無(wú)菌采集犬血液不少于2mL,室溫或37℃靜置60min，4℃放置1h后, 6000r /min離心5min,收集上清,-20℃以下保存待檢。無(wú)菌采集犬唾液棉拭子放置于有PBS的2mL離心管中，4℃放置2h后，擠壓棉球，并離心取上清液，-20℃以下保存待檢。

1.3 主要設(shè)備

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan SKY)，熒光定量PCR儀(BIO RAD美國(guó)伯樂(lè))，高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher)。

1.4 主要試劑

狂犬病 ELISA 檢測(cè)試劑盒(上海艾研生物科技有限公司)、狂犬病熒光RT-PCR試劑盒(北京海森通生物科技有限責(zé)任公司)。

1.5 檢測(cè)方法

ELISA檢測(cè)方法，將分離后的血清，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。熒光RT-PCR檢測(cè)方法，所有采集的拭子參照熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 結(jié)果判定

ELISA檢測(cè)結(jié)果PI(阻斷率)>35%判斷為陽(yáng)性。熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Ct值≤30.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測(cè)結(jié)果

282份犬血清進(jìn)行免疫抗體檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1?？傟?yáng)性率為74.1%。其中2011年、2013年、2015年分別為61.8%、56.0%、67.9%，低于70%為免疫不合格；2019年、2020年抗體陽(yáng)性率較高，均超過(guò)90%，免疫效果良好。

表1 2011—2020年蒙自市7個(gè)街道(鄉(xiāng)、鎮(zhèn))犬只狂犬病免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 2011-2020年免疫抗體水平變化結(jié)果分析

如圖1可見(jiàn)，免疫抗體水平10年呈上升趨勢(shì)。其中2013年最低，2019年最高。

圖1 2011—2020年狂犬病免疫抗體水平趨勢(shì)圖

2.3 抗原檢測(cè)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，124份犬唾液棉拭子檢測(cè)結(jié)果，2017年和2020年陽(yáng)性率均為23.1%，表明該地區(qū)有犬感染狂犬病病毒，并出現(xiàn)發(fā)病犬傷人的情況。

表2 2011—2020年犬狂犬病抗原檢測(cè)結(jié)果

2.4 地理分布

根據(jù)對(duì)抗原陽(yáng)性樣品的來(lái)源追蹤，發(fā)現(xiàn)抗原陽(yáng)性樣品來(lái)自西北勒和期路白2個(gè)鄉(xiāng)，且陽(yáng)性樣品數(shù)均為3份，其他街道(鄉(xiāng)、鎮(zhèn))均未檢出抗原陽(yáng)性樣品。

2.5 年齡分布

西北勒和期路白2個(gè)鄉(xiāng)出現(xiàn)狂犬病發(fā)病犬咬人情況，對(duì)被咬傷的12人進(jìn)行年齡調(diào)查，結(jié)果顯示2～8歲有3人，24～45歲有4人，50～86歲有5人，成年人的占比高于未成年人，這可能與被咬傷者的活動(dòng)能力和活動(dòng)軌跡有一定關(guān)系。

3 討論

3.1 蒙自市7個(gè)街道(鄉(xiāng)、鎮(zhèn))發(fā)病犬流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

在對(duì)發(fā)病犬和被病犬咬傷病例的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，時(shí)間在5—9月，此時(shí)正處于夏秋季節(jié)，天氣炎熱，犬易煩躁發(fā)狂，這一結(jié)果與其他地區(qū)報(bào)道的病例多發(fā)生在氣候溫暖的季節(jié)，具有明顯的季節(jié)性特征[7，8]相符合，發(fā)病犬出現(xiàn)在蒙自市相對(duì)較偏遠(yuǎn)山區(qū)鄉(xiāng)，且發(fā)病犬未經(jīng)免疫。有報(bào)道，我國(guó)農(nóng)村犬狂犬病免疫率為48.7%，城市中犬的整體免疫率約為59.3%[6]，農(nóng)村地區(qū)的免疫率低于城市。狂犬病目前尚無(wú)特效治療方法，只能依靠疫苗免疫預(yù)防，該地犬發(fā)病可能與未經(jīng)疫苗免疫有直接聯(lián)系，增加了狂犬病發(fā)病概率。本次抗原檢測(cè)2017年有3例犬狂犬病發(fā)病病例出現(xiàn)且咬傷8人，有資料顯示，我國(guó)因患狂犬病致死案例就有90例，僅次于印度居世界第二[9]?？袢〔《镜膫鞑ネ緩蕉喾N多樣，可通過(guò)舔咬直接接觸傳播，也可污染周?chē)h(huán)境，造成間接傳播[10]，同群犬中可能通過(guò)相互舔咬或污染環(huán)境而造成交叉感染。

3.2 狂犬病疫苗免疫中存在的問(wèn)題

2011—2020年抗體陽(yáng)性率基本呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，2013 年最低，2019年最高，其次是2020年，出現(xiàn)這種情況可能與使用疫苗的種類(lèi)有關(guān)，2019年、2020年均使用狂犬病弱毒疫苗，其他年份均使用狂犬病滅活疫苗，陳玉華[11]在試驗(yàn)中得出結(jié)論，PRRS弱毒疫苗的免疫效果明顯優(yōu)于滅活苗。盧毅[12]指出高致病性豬藍(lán)耳病弱毒疫苗的抗體水平和抗體上升速度較快,免疫作用較強(qiáng),在使用時(shí)可以?xún)?yōu)先考慮弱毒疫苗。弱毒疫苗具有免疫原性好、免疫期長(zhǎng)等特性，結(jié)合蒙自市7個(gè)街道(鄉(xiāng)、鎮(zhèn))的疫苗免疫合格率，在狂犬病的免疫預(yù)防時(shí)，應(yīng)該優(yōu)先采用弱毒疫苗進(jìn)行免疫。

3.3 狂犬病的危害及防控

此次抗體檢測(cè)分析，每年采集到的樣本量較少，可能會(huì)造成抗體檢測(cè)結(jié)果有誤差，但是也能說(shuō)明蒙自市狂犬病免疫抗體陽(yáng)性率逐年增加；抗原檢測(cè)結(jié)果暴露出狂犬病在該地區(qū)存在，且狂犬病的危害較為嚴(yán)重，不僅是對(duì)易感動(dòng)物，人也容易被病毒攜帶動(dòng)物咬傷、抓傷，導(dǎo)致狂犬病的發(fā)生?？袢〉姆揽貞?yīng)按照不同地區(qū)制定不同的狂犬病免疫程序，每年有計(jì)劃地開(kāi)展狂犬病免疫抗體和病原學(xué)監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握免疫效果和疫情動(dòng)態(tài)。同時(shí)，定期開(kāi)展狂犬病流行病學(xué)調(diào)查，掌握犬只養(yǎng)殖情況和免疫情況，分析狂犬病防控過(guò)程中存在的問(wèn)題及疫情風(fēng)險(xiǎn)因素，提出科學(xué)防控方案。加強(qiáng)狂犬病對(duì)社會(huì)公共安全危害的宣傳力度，提高人們對(duì)狂犬病的認(rèn)知度，增強(qiáng)人們對(duì)犬只咬傷、抓傷的處理意識(shí)，完善規(guī)范養(yǎng)犬管理制度，要求對(duì)所有犬只進(jìn)行拴養(yǎng)，降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。增強(qiáng)人們的防護(hù)意識(shí)，注重環(huán)境消毒工作，對(duì)疑似發(fā)病犬或死亡犬進(jìn)行上報(bào)，集中到固定地點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格消毒并無(wú)害化處理，不隨意丟棄，不私自處理，以免造成疫病傳播。