楊 春，吳韜奮

（上海中醫(yī)藥大學創(chuàng)新中藥研究院藥物安全評價研究中心，上海 201203）

實驗動物是現(xiàn)代醫(yī)藥研究中的必備材料。實驗動物設施的環(huán)境指標與動物實驗的結果密切相關，而籠盒飼養(yǎng)中的墊料材料也是影響實驗動物健康和實驗結果的重要環(huán)境因素。木屑和刨花通常是木材加工業(yè)的副產(chǎn)物，來源不明，成分混雜，難以控制質量，可能造成動物的各種毒性反應增多。有研究表明，六價鉻含量較高時可導致小鼠出現(xiàn)肝腎毒性[1]。目前接觸性墊料材料種類有木材墊料、玉米芯、秸稈生紙、新型材料[2]等，又有研究表明稻殼類墊料可能對涉及到肝臟藥物代謝的研究結果有一定影響[3]。近年來，有研究采用網(wǎng)籠模式對大鼠進行飼養(yǎng)，與傳統(tǒng)模式相比，既節(jié)約了墊料，又能避免墊料污染、農(nóng)藥殘留、粉塵多、墊料被大鼠食用等一系列墊料飼養(yǎng)的弊端[4]。雖有部分研究表明大鼠網(wǎng)籠飼養(yǎng)與墊料飼養(yǎng)一樣，可以保證大鼠的正常生長發(fā)育，但這類實驗的研究內(nèi)容和指標較少，未能涵蓋大鼠的臟器指數(shù)、血液學及血液生化等更全面的生理指標，無法得知網(wǎng)籠飼養(yǎng)對大鼠的這些方面是否造成影響[4]。而血液生化指標、臟器質量及系數(shù)往往是各類大鼠實驗的重要指標數(shù)據(jù)[5-7]?；诖耍緦嶒炛饕^察網(wǎng)籠及玉米芯墊料兩種不同的飼養(yǎng)模式對SD 大鼠的影響，探討網(wǎng)籠飼養(yǎng)對SD 大鼠各項生理指標的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于2018 年5 月16 日從上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2017-0005]采購40只SPF 級SD 大鼠（20♂20♀），雄性大鼠體重為210～240 g，雌性大鼠體重為170～210 g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準進行（審查號：PZSHUTCM200522001）。

1.2 方法 所有大鼠按體重隨機分為隨機分為網(wǎng)籠組和玉米芯墊料組，每組20 只（10♂10♀），網(wǎng)籠組使用網(wǎng)籠飼養(yǎng)，玉米芯墊料組使用玉米芯墊料飼養(yǎng)。每籠5 只，SPF 飼養(yǎng)室常規(guī)飼養(yǎng)10 周。

1.3 觀察指標 每天觀察大鼠的精神、活動、糞便等臨床征狀：觀察者按專業(yè)術語對癥狀進行描述，結合后續(xù)統(tǒng)計分析情況進行綜合評價。每周稱量1 次體重（BSA2201-CW 型電子秤）：對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。于第10 周解剖檢查，對主要臟器（心、肝、脾、腎）進行肉眼觀察：觀察者按專業(yè)術語對癥狀進行描述，結合后續(xù)檢查指標進行綜合評價。稱量臟器質量（AR2130 型電子天平）并計算其臟器指數(shù)：對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。腹主動脈采集血液，1 ml 血液使用EDTA-K2 抗凝，采集后立即顛倒輕搖混勻，1 h內(nèi)使用BAYER ADVIA 202li 五分類血球儀測定血液學（WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC）指標：對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。3 ml 血液不抗凝，放置約40 min（室溫），3500 r/min 離心10 min，取血清，使用日立7080 全自動生化分析儀測定血液生化學（ALT、AST、BUN、CREA）指標：對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。解剖前1 天將大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水過夜，采集約16 h的尿液。使用羅氏朱麗亞Ⅱ型尿液分析儀對尿蛋白、尿糖等指標進行半定量檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 本實驗所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計，計量資料采用（）表示，行獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 為統(tǒng)計學意義顯著。

2 結果

2.1 兩組體重比較 網(wǎng)籠組雄性大鼠在實驗開始后第1 周體重低于玉米芯墊料組，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.01），但在之后幾周，體重恢復。第2～10 周，兩組體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組體重比較（，g）

表1 兩組體重比較（，g）

注：與玉米芯墊料組比較，**P＜0.01

2.2 兩組臟器重量及系數(shù)比較 網(wǎng)籠組雄性大鼠肝臟質量低于玉米芯墊料組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩組其他臟器質量及系數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組臟器重量及系數(shù)比較（n=20，）

表2 兩組臟器重量及系數(shù)比較（n=20，）

注：與玉米芯墊料組比較，*P＜0.05

2.3 兩組血液學檢查比較 網(wǎng)籠組雄性大鼠RBC 高于玉米芯墊料組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩組其他血液學指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 兩組血液學檢查比較（n=20，）

表3 兩組血液學檢查比較（n=20，）

注：與玉米芯墊料組比較，*P＜0.05

2.4 兩組血液生化檢測比較 網(wǎng)籠組雄性大鼠ALT、CREA 低于玉米芯墊料組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組其他生化指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 兩組血液生化檢測比較（n=20，）

表4 兩組血液生化檢測比較（n=20，）

注：與玉米芯墊料組比較，**P＜0.01

2.5 兩組尿液檢測結果比較 網(wǎng)籠組雄性大鼠尿液白細胞、尿蛋白、尿酮體指標陽性比例高于玉米芯墊料組雄性大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組尿液生化指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 兩組尿液檢測結果比較（n，）

表5 兩組尿液檢測結果比較（n，）

3 討論

實驗動物在現(xiàn)代醫(yī)藥研究中具有舉足輕重的地位，特別是近年SPF 級實驗動物的大量普及，為科學研究提供了統(tǒng)一穩(wěn)定的實驗材料。另外，屏障環(huán)境的建設與發(fā)展也取得了長足的進步，實驗動物的生活大環(huán)境、小環(huán)境引起了研究者的重視[8]，這關乎著動物實驗結果的準確性。墊料作為實驗動物長期接觸物質，其質量的優(yōu)劣與實驗動物密切相關，如墊料重金屬超標會直接影響實驗動物。目前，墊料的種類繁多且質量難以控制。如刨花類的墊料發(fā)散出的芳香為揮發(fā)性物質，可誘導肝微粒酶活性，對肝細胞產(chǎn)生損害[9]。研究發(fā)現(xiàn)玉米芯具有強吸水性、干燥性、吸氨性、保溫性，動物適應性好，常規(guī)消毒后無細菌和真菌殘留，是一種較理想的SPF 墊料[10，11]。

與墊料飼養(yǎng)比較，使用網(wǎng)籠飼養(yǎng)具有避免污染物、無粉塵、節(jié)約成本等優(yōu)點。網(wǎng)籠飼養(yǎng)與墊料飼養(yǎng)同樣可以保證大鼠的正常生長。目前已有研究對大、小鼠進行了網(wǎng)養(yǎng)生長發(fā)育的研究，但僅局限于體重、行為、供食量和供水量等指標。而本實驗納入了更加豐富的指標，包括大鼠血液學、血液生化、臟器質量及系數(shù)等，旨在更全面的評估網(wǎng)籠飼養(yǎng)方式對SD大鼠的影響。

本研究表明，網(wǎng)籠組雄性大鼠實驗開始后第1周體重低于玉米芯墊料組，但隨后幾周體重恢復，與玉米芯墊料組基本一致。推測主要由于實驗前大鼠飼養(yǎng)環(huán)境均為玉米芯墊料飼養(yǎng)，改為網(wǎng)籠飼養(yǎng)后，生活方式發(fā)生改變，初期的不適應造成體重增長緩慢，待逐漸適應網(wǎng)籠飼養(yǎng)后，體重恢復正常。

本研究顯示，網(wǎng)籠組雄性大鼠肝臟重量小于玉米芯墊料組雄性大鼠。血液生化檢測方面，網(wǎng)籠組雄性大鼠的丙氨酸氨基轉移酶及肌酐指標低于玉米芯墊料組雄性大鼠。以上兩方面的數(shù)據(jù)趨勢與部分文獻報道一致[12]，可能意味著由于玉米芯墊料能增加動物的解毒能力，造成肝臟和腎臟的代償性增大。同時由于實驗條件限制，本實驗動物數(shù)量較少，很難判定玉米芯墊料是否對大鼠肝臟或腎臟有顯著影響。若需進一步明確玉米芯墊料對大鼠肝臟或腎臟的影響，應增加動物數(shù)量，并延長動物飼養(yǎng)周期，進一步深入探究。血液學方面，網(wǎng)籠組雄性大鼠紅細胞數(shù)高于玉米芯墊料組雄性大鼠。在實驗中期，抓取動物稱重及標號過程中發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)籠組大鼠的抓力大于玉米芯墊料組大鼠的。經(jīng)觀察，發(fā)現(xiàn)由于網(wǎng)籠組的籠更利于大鼠攀爬，網(wǎng)籠組大鼠運動量多于玉米芯墊料組。因此推測，可能是由于運動量的增多，導致網(wǎng)籠組雄性大鼠紅細胞數(shù)較高[13]。尿液檢查顯示，網(wǎng)籠組雄性大鼠尿液的白細胞、尿蛋白、尿酮體指標陽性數(shù)高于玉米芯墊料組雄性大鼠，推測可能是由于網(wǎng)籠組籠更換頻率低，造成大鼠尿路感染所致。即衛(wèi)生條件的影響，而非飼養(yǎng)方式的影響結果。雖然網(wǎng)籠組大鼠廢棄物托盤每周更換3 次，但并未規(guī)定更換籠具。由于網(wǎng)籠中未觀察到明顯排泄物堆積，故一般飼養(yǎng)過程中只定期每月1 次擦拭消毒網(wǎng)籠，并未像玉米芯墊料籠盒，每周更換[14]。這可能造成網(wǎng)籠籠具表面微生物繁殖，對動物造成影響。

本實驗原計劃每周測定動物攝食量，但于第一周稱量耗食量時發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)籠組廢棄物托盤中有大量飼料顆粒，推測是由于大鼠在啃食飼料過程中，飼料顆粒通過網(wǎng)籠隙縫掉入廢棄物托盤所致。而玉米芯墊料組的飼料顆粒經(jīng)啃食后，掉入玉米芯墊料中后，大鼠仍能夠繼續(xù)食用，這導致攝食量的測定無法反映兩組動物攝食的實際情況，故本實驗取消了攝食量的測定。在飼養(yǎng)過程中，原計劃每周更換2 次玉米芯墊料及廢棄物托盤，但在實際操作中，每周更換2 次會導致惡臭感提升[15]。因此在飼養(yǎng)后期提高了廢棄物托盤的更換頻率，由每周2 次改為每周3 次，環(huán)境中的惡臭感明顯好轉。

由于網(wǎng)籠飼養(yǎng)飼養(yǎng)模式與墊料飼養(yǎng)模式的差異，應規(guī)范網(wǎng)籠飼養(yǎng)模式的相關操作流程，避免對實驗造成影響?？紤]到網(wǎng)籠飼養(yǎng)與大鼠一些正常自然習性不一致，可能會對一些實驗產(chǎn)生影響。本實驗由于條件影響，實驗周期為10 周，未能考察長期飼養(yǎng)對大鼠足踝關節(jié)的影響。但長期飼養(yǎng)試驗中，尤其是對90、180 d的長期毒性試驗，應該需考慮飼養(yǎng)方式可能對足踝等關節(jié)的影響。同時，由于網(wǎng)籠飼養(yǎng)與大鼠正常做窩產(chǎn)仔的自然習性不一致，與孕產(chǎn)有關的研究，如生殖毒性的相關研究，建議采用傳統(tǒng)的木屑或玉米芯墊料進行飼養(yǎng)[16]。

總之，大鼠網(wǎng)籠飼養(yǎng)方式與傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式一致，都可以保證大鼠的正常生長發(fā)育。但網(wǎng)籠飼養(yǎng)有一定的優(yōu)勢，不僅節(jié)約墊料，還能避免墊料污染、農(nóng)藥殘留、粉塵多、墊料被大鼠食用等弊端。