查作霖，陳福軍

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸科，黑龍江 佳木斯 154007）

目前，結(jié)腸癌（colon cancer）已成為最常見的惡性腫瘤之一，每年有超過100 萬新發(fā)病例[1]。盡管結(jié)腸癌的治療方法多種多樣，但結(jié)腸癌患者的生存率仍然很低[2]。結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展與很多代謝與分子機(jī)制相關(guān)[3]。因此，了解結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的藥物具有重要意義。越來越多的醫(yī)學(xué)研究表明微小RNA（MicroRNA）參與了結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。MicroRNA-613 在許多癌癥中有抑癌作用。然而，關(guān)于MicroRNA-613 在結(jié)腸癌中的具體分子機(jī)制和調(diào)控作用尚不清楚。MicroRNA 是大小為19～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’-UTR結(jié)合從而負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[4-6]。MicroRNA 在許多不同的生物代謝過程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[7,8]。MicroRNA-613 在結(jié)腸癌組織和患者血液樣本中表達(dá)增加，其可能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在G1期誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，ATOH1 和FMNL2的mRNA的3’-UTR 與MicroRNA-613 有結(jié)合位點(diǎn)。且ATOH1 和FMNL2的異常表達(dá)可能影響MicroRNA-613 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9,10]。這些研究結(jié)果表明MicroRNA-613 通過調(diào)節(jié)ATOH1 和FMNL2 在結(jié)腸癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究重點(diǎn)驗(yàn)證MicroRNA-613 在結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 miRcute 血清/血漿miRNA 提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）；miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）；miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）；無RNA 酶雙蒸水（天根生化科技有限公司）；miRNA 檢測引物has-U6（天根生化科技有限公司）；miRNA 檢測引物has-miR-613（天根生化科技有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）、瓊脂糖凝膠電泳儀（美國BIO-RAD 公司）、反轉(zhuǎn)錄PCR（美國ABI 公司）、Eppendorf U410-86 低溫冰箱（德國eppendorf 公司）、上海天能Tanon 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本收集 收集2019 年12 月-2020 年12月在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸科手術(shù)治療的結(jié)腸占位患者的結(jié)腸癌組織及癌旁正常腸組織，包括病理低分化、高分化和正常組織各20 例，分別作為輕度組、重度組和對照組。組織標(biāo)本離體后迅速冷凍至液氮中，并保存在-80 ℃冰箱中，直至RNA 提取。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為結(jié)腸癌、TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期的患者，且手術(shù)方式為根治性手術(shù)；②未接受過任何腫瘤相關(guān)性手術(shù)、放化療及其他腫瘤相關(guān)治療；③為原發(fā)腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等其他器官功能障礙者。

1.3.2 血液標(biāo)本收集 采集所有受檢者清晨空腹靜脈血10 ml，室溫下3000 r/min 離心10 min，移去細(xì)胞或細(xì)胞碎片；收集上層血清，然后在4 ℃，3000 r/min 離心10 min，進(jìn)一步除去殘留血細(xì)胞；小心吸取上層血清至新的離心管，置于80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 qRT-PCR 檢測miR-613 表達(dá) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（qRT-PCR）檢測各組組織標(biāo)本、血液標(biāo)本中miR-613的表達(dá)水平，比較各組表達(dá)水平的差異。組織標(biāo)本、血液標(biāo)本中的miRNA 提取分離；合成miRNA cDNA 第一鏈瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序：①RNA 加A 尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 ℃，60 min；②酶失活反應(yīng)95 ℃，3 min。miRcute增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測；按實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量計(jì)算各試劑總量，分裝到反應(yīng)管中，最后加入反應(yīng)體系中的自備引物和miRNA cDNA。按順序加入試劑：2×miRcute 增強(qiáng)型microRNA 定量預(yù)混試劑、Reverse Primer、50×ROX 對照染料和引物，加入1.5 ml 無RNA 酶離心管中，最后加入樣本的cDNA?；靹?，離心，上機(jī)，設(shè)置反應(yīng)程序，觀察結(jié)果。

1.3.4 ELISA 實(shí)驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量測定結(jié)腸癌患者組織Atoh1，F(xiàn)MNL2的水平。

1.3.5 Western Blot 分析FMNL2 和Atho1 表達(dá) 蛋白裂解：組織加入裂解液，4 ℃裂解2 h 后，12,000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清，放于液氮罐或-80 ℃冰箱中，每次電泳之前進(jìn)行蛋白測定。裂解蛋白的含量測定，蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗反應(yīng)，顯色反應(yīng)，凝膠圖象分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性采用Pearson 線性相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電泳情況 miRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。qRT-PCR 檢測各組樣本，溶解曲線分析未見雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，沒有非特異性擴(kuò)增，所有樣品均己進(jìn)入擴(kuò)增平臺(tái)期，反應(yīng)條件設(shè)定準(zhǔn)確。

圖1 組織樣本cDNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 各組組織勻漿中ATOH1 和FMNL2 表達(dá)比較對照組、輕度組、重度組組織勻漿中ATOH1 表達(dá)量逐漸升高，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、輕度組、重度組組織勻漿中FMNL2 表達(dá)量逐漸降低，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組組織勻漿中ATOH1 和FMNL2 表達(dá)比較（，ng/ml）

表1 各組組織勻漿中ATOH1 和FMNL2 表達(dá)比較（，ng/ml）

注：**表示與對照組比較，P＜0.05

2.3 各組組織中ATOH1 和FMNL2 表達(dá)比較 對照組、輕度組、重度組組織中ATOH1 表達(dá)量逐漸升高，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、輕度組、重度組組織中FMNL2 表達(dá)量逐漸降低，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2、圖3。

表2 各組組織樣本中ATOH1 和FMNL2 表達(dá)量比較（）

表2 各組組織樣本中ATOH1 和FMNL2 表達(dá)量比較（）

注：**表示與對照組比較，P＜0.05

圖2 Western Blot 分析FMNL2的表達(dá)

圖3 Western Blot 分析ATOH1的表達(dá)

2.4 各組組織樣本中miRNA-613 表達(dá)比較 對照組、輕度組、重度組miRNA-613 表達(dá)水平逐漸升高，且各組miRNA-613 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組組織樣本中miRNA-613 表達(dá)比較（）

表3 各組組織樣本中miRNA-613 表達(dá)比較（）

注：**表示與對照組比較，P＜0.05

2.5 miRNA-613 和ATOH1、FMNL2的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析顯示，miRNA-613 和ATOH1、FMNL2 表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，見表4。

表4 miRNA-613 與ATOH1 和FMNL2的相關(guān)性

3 討論

miRNA 是一類重要的小分子，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明，miRNA的表達(dá)失調(diào)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。miRNA-613 在許多癌癥中起著抑癌作用，但目前miRNA-613 在結(jié)腸癌進(jìn)展中的確切作用尚不清楚。結(jié)腸癌的發(fā)生是由于癌細(xì)胞無限增殖和不受調(diào)控，癌基因和原癌基因被激活，抑癌基因被抑制引起的[11]。研究認(rèn)為，miRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化和結(jié)腸癌的發(fā)生密不可分。

研究發(fā)現(xiàn)[12]，miRNA-613 通過靶向ATOH1 促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，該研究發(fā)現(xiàn)了miRNA-613 在結(jié)腸癌中的表達(dá)和功能，并闡明了miRNA-613調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展的分子機(jī)制。另外，miRNA-613 在結(jié)腸癌組織樣品和人結(jié)腸癌細(xì)胞系中上調(diào)，這也促進(jìn)了增殖、侵襲和遷移的結(jié)腸癌細(xì)胞數(shù)量。雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因測定證實(shí)ATOH1 是miRNA-613的目標(biāo)mRNA，Jun N 端激酶1（JNK1）通路和粘蛋白2（MUC2）是miRNA-613/ATOH1的潛在下游蛋白。另有研究發(fā)現(xiàn)[13]，miRNA-613 可靶向FMNL2 并抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展。miRNA-613 在結(jié)腸癌細(xì)胞系和組織樣本中表達(dá)量的變化，說明其可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期停滯。而FMNL2 是結(jié)腸癌細(xì)胞中miRNA-613的直接結(jié)合靶點(diǎn)，F(xiàn)MNL2的過表達(dá)可影響miRNA-613 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此，目前研究認(rèn)為miRNA-613 主要通過調(diào)節(jié)FMNL2 在結(jié)腸癌的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。

本次研究顯示，各組樣本中miRNA-613的表達(dá)水平均高于對照組，同時(shí)重度組高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA 實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，ATOH1 表達(dá)增高，且重度組高于輕度組；而FMNL2 表達(dá)降低，且重度組低于輕度組。另外，通過miRNA-613 與ATOH1 和FMNL2的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-613的表達(dá)和ATOH1、FMNL2的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），說明miRNA-613 是結(jié)腸癌的致癌基因，并通過靶向ATOH1、FMNL2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，其可能是通過激活JNK1 途徑和上調(diào)MUC2 發(fā)揮作用，miRNA-613 有望成為治療結(jié)腸癌的新藥物的干預(yù)靶點(diǎn)。miRNA-613調(diào)控ATOH1 和FMNL2 在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中有重要的分子作用，進(jìn)而可以作為預(yù)測結(jié)腸癌嚴(yán)重程度的分子指標(biāo)[14-16]。未來，miRNA-613、ATOH1 和FMNL2 可能成為臨床上快速診斷結(jié)腸癌的重要分子標(biāo)志物。

綜上所述，miRNA-613 通過影響ATOH1 和FMNL2的表達(dá)，從分子水平上調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。另外，miRNA-613的表達(dá)與ATOH1 和FMNL2均呈負(fù)相關(guān)，可互相作為分子標(biāo)志物。但是其調(diào)控結(jié)腸癌具體分子機(jī)制尚未完全明確，還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。