鐘倫坤，胡文健，周興瑋，何 嫻，朱佳麗，陳 龍，田 柳，邵建華，孫永東

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，四川 瀘州 646699）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）多發(fā)于2～7 歲，是兒童聽力受損的最常見原因，主要以中耳積液、聽力下降為表現(xiàn)特征，治療不徹底或遷延不愈可引發(fā)多種嚴重的并發(fā)癥，嚴重影響患兒的言語、學習和行為問題[1]。目前對于SOM的治療尚無統(tǒng)一的藥物[2]。中醫(yī)認為SOM的主要病因是正氣不足，內蘊濕熱，外受風邪，致熱毒墮盛，循肝膽經(jīng)上沖于耳竅所致。清竅膠囊是我科獨創(chuàng)治療SOM的經(jīng)驗協(xié)定方藥，其具有健脾益氣，去濕化濁之功效，效果顯著。已發(fā)現(xiàn)能改善機體免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，可以達到標本兼治，緩減中耳分泌液的產(chǎn)生，最終吸收消失，使閉塞的咽鼓管逐漸通暢，同時改善耳蝸微循環(huán)[3]。研究報道自身抗體的產(chǎn)生是這些疾病的另一個特征，涉及T 和B 細胞之間的相互作用以及T 細胞亞群之間的相互作用，包括CD4+T輔助細胞（例如Th1、Th2、Th17）、調節(jié)性T 細胞（Tregs）[4]。但目前關于清竅膠囊作用SOM的相關機制研究尚缺乏，因此，本研究探討清竅膠囊對分泌性中耳炎大鼠Th17、Treg 細胞及炎性因子的影響，為SOM的治療提供依據(jù)，同時也為清竅膠囊的機制研究及今后基于網(wǎng)絡藥理學分析，系統(tǒng)綜合地觀察清竅膠囊對SOM的干預與影響奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 雌性SD 大鼠30 只，體質量（240±10）g，購于成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（川）2019-189。所有大鼠均維持在20 ℃～24 ℃，相對濕度45%～55%，光周期正常（光照12 h/黑暗12 h）條件飼養(yǎng)，大鼠被給予普通顆粒飼料飼養(yǎng)。研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院委員會機構實驗動物倫理委員會批準，并按照實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 藥物 清竅膠囊為醫(yī)院內制劑，批準文號：川藥制字Z20080310，配方為：玄參9 g、生地9 g、丹參12 g、川牛膝6 g、僵蠶4 g、當歸9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。強的松購自浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格：5 mg/片，國藥準字H33021207。烏拉坦購自湖北恒綠源科技有限公司，規(guī)格：0.5 g/片，EINECS 編號：51-79-6。

1.3 實驗儀器和試劑 FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；sigma 3K15 離心機（德國Sigma 公司產(chǎn)品）；SpectraMAX Plus384 酶標儀（美谷分子儀器有限公司）。卵清蛋白（OVA）購自Sigma（美國）；IL-4（貨號：ZC-36402）、TGF-β（貨號：ZC-37644）、IL-6（貨號：ZC-36404）、IFN-γ（貨號：ZC-36294）、IL-10（貨號：ZC-36379）、IL-17（貨號：ZC-36386）ELISA試劑盒（上海茁彩）。

1.4 方法

1.4.1 分泌性中耳炎大鼠模型構建 大鼠飼養(yǎng)于恒溫（20 ℃～25 ℃）、恒濕（50%±5%），自然采光，自由飲水條件下。隨機選取24 只進行分泌性中耳炎造模[5]：將1.2 mg 卵清蛋白溶于0.6 ml PBS 緩沖液配置成溶液，同時使用5.14 mg的氫氧化鋁作為免疫佐劑，腹腔注射，1 次/周，共2 周，此過程為全身致敏階段，2 周后，用20%烏拉坦以5 ml/kg的劑量腹腔內注射麻醉大鼠，將15 μl 配置的OVA/PBS 混合液經(jīng)鼓膜前下方注入鼓室，24 h 后再次麻醉大鼠，觀察鼓膜狀態(tài)，注射第2 次，此為耳內激發(fā)階段。24 h 后用耳內鏡觀察和記錄鼓膜形態(tài)和中耳腔積液情況，正常大鼠鼓膜無充血，光滑透亮，錘骨柄和光錐標志清晰，鼓室無積液。建模后可見大鼠鼓膜充血，光錐消失，鼓室混濁，鼓室積液征，建模基本成功。

1.4.2 試驗分組及給藥方法 24 只分泌性中耳炎大鼠造模成功后，隨機分為模型組（SOM）、強的松組（PDN，0.003 g/100 ml）、清竅膠囊低劑量治療組（QQJN-L，0.36 g/100 ml）、清竅膠囊高劑量治療組（QQJN-M，0.72 g/100 ml），每組6 只，并設置對照組（剩余未造模大鼠6 只）。灌胃藥物容積均為0.2 ml/10 g 體質量，清竅膠囊高劑量溶液配成濃度為0.72 g/100 ml，清竅膠囊低劑量溶液濃度為0.36 g/100 ml，強的松配成0.003 g/100 ml 溶液。模型組與對照組灌服相同容積的蒸餾水，1 次/d 給藥，連續(xù)給藥14 d。

1.4.3 樣本采集 血樣采集：給藥結束后，抽取所有大鼠腹主動脈血液，3000 r/min 低溫離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。組織樣本采集：脫頸處死大鼠，立即分離出大鼠脾臟和胸腺，剪少量脾臟和胸腺組織，加入適量淋巴細胞分離液，充分碾磨胸腺組織至無塊狀物，過濾，加入1640 培養(yǎng)基，15 000 r/min，20 ℃離心30 min，吸取淋巴細胞層，用于后續(xù)流式細胞檢測。

1.4.4 指標檢測 ①ELISA 檢測血清因子：將離心采集的血清，按照ELISA 試劑盒說明操作檢測血清IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17的濃度。②流式細胞檢測脾臟和胸腺Th17/Treg 細胞：取分離好的脾臟和胸腺淋巴細胞，稀釋至1×108/ml，取100 μl加入流式測定管中，分別加入5 μl FITC 標記的CD4 McAb、5 μl APC 標記的IL-17 McAb 或5 μl FITC 標記的CD4 McAb、5 μl APC 標記的CD25 McAb 后混勻，避光孵育約20 min，F(xiàn)low Cytometry Staining Buffer 1 ml 洗滌后，1400 r/min 離心5 min，棄上清液，加PBS 洗2 遍，棄上清液，加入PBS 緩沖液，調整細胞濃度至1×106個細胞/ml，于FACSCalibur 流式細胞儀檢測，CD4+IL-17+為Th17 含量，CD4+CD25+Treg 細胞為Treg 含量。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示使用（），比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計學意義顯著。

2 結果

2.1 各組血清指標比較 與對照組比較，模型組TGFβ、IL-6、IFN-γ、IL-17 水平升高，IL-10、IL-4 水平降低（P＜0.01）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量治療組可降低模型大鼠TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-17 水平，升高IL-10、IL-4 水平（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清指標比較（，pg/ml）

表1 各組血清指標比較（，pg/ml）

注：與對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.2 各組大鼠脾臟Th17、Treg 細胞含量 流式細胞檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠脾臟Th17、Treg 細胞含量升高（P＜0.05）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊低、高劑量治療組均可降低模型大鼠脾臟Th17、Treg 細胞（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠脾臟流式細胞檢測圖及結果比較

2.3 各組大鼠胸腺Th17、Treg 細胞含量 流式細胞檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠胸腺Th17、Treg 細胞含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，清竅膠囊高劑量治療組可降低模型大鼠胸腺Th17、Treg 細胞含量（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠胸腺流式細胞檢測圖及結果比較

3 討論

針對SOM的治療目前尚無統(tǒng)一有效的藥物，已有證據(jù)發(fā)現(xiàn)中藥具有副作用小，藥物作用靶點多等優(yōu)勢，現(xiàn)有研究也正在尋找療效確切并且對全身及局部均有效的中成藥來治療[6]。中醫(yī)認為SOM 為“耳脹”“耳閉”，主要發(fā)病原因為風邪外襲、痞塞耳竅、上壅耳竅、濕濁困耳等，辨證論治并采取相應的治療方法，可改善SOM 臨床癥狀。清竅膠囊主要由玄參、丹參、當歸、川牛膝、生地黃等藥物組成，方中玄參具有清熱涼血，滋陰降火之功效，現(xiàn)代研究表明其能擴張外周血管[7]。本課題組前期研究證實清竅膠囊可通過降低SOM 動物模型血清粘附分子表達水平來減輕大鼠聽泡粘膜炎癥反應，抑制大鼠聽泡粘膜細胞增生，從而治療分泌性中耳炎[8]。此外，劉桂榮等[9]通過動物實驗研究表明清竅膠囊可降低SOM 大鼠外周血清中IL-4的表達水平，干預Th2/Th1的比值進而治療SOM。由此看出，清竅膠囊是通過多個靶點起作用，但由于更進一步機制研究尚缺乏，故本研究探討清竅膠囊對分泌性中耳炎大鼠Th17、Treg 細胞及炎性因子的影響，旨在為SOM的治療提供依據(jù)。

目前，SOM的發(fā)病機制尚不清晰，然而研究顯示免疫因素在SOM 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但免疫反應的調控機制有待深入研究[10]。在自身抗原的刺激下，Treg 細胞和其他T 細胞亞群可以在胸腺中發(fā)育。胸腺Treg 細胞在維持免疫耐受中的關鍵作用已通過觀察3 日齡新生小鼠胸腺切除誘導T 細胞介導的自身免疫得到證實[11]。Treg 抑制功能的維持需要轉錄因子Foxp3的表達，其功能本身受多種翻譯后修飾的調節(jié)。Treg 細胞分泌抑制性細胞因子（TGF-β、IL-10）及通過CD39 胞核水解ATP 抑制免疫反應，而Foxp3 可在TGF-β 存在的情況下在體外誘導Treg[12]。輔助性T 細胞（Th17）由視黃醇相關孤兒受體γt（RORγT）誘導，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[13]。全基因組關聯(lián)研究強調了Th17 細胞在免疫性疾病中的中心作用，這些研究將Th17 細胞中優(yōu)先表達的基因與多種疾病聯(lián)系起來，包括牛皮癬、炎癥性腸病和強直性脊柱炎[14，15]。本實驗研究清竅膠囊對分泌性中耳炎Th17、Treg 細胞及炎性因子的調節(jié)作用結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠TGF-β、IL-6、IL-17、IFN-γ、Th17 細胞、Treg細胞水平明顯升高，IL-10、IL-4 水平明顯降低，而清竅膠囊高劑量可明顯降低模型大鼠TGF-β、IL-6、IL-17、IFN-γ、Th17 細胞、Treg 細胞水平，明顯升高IL-10、IL-4 含量，表明清竅膠囊可有效地調節(jié)Treg 和Th17 細胞介導的中耳炎。

綜上所述，清竅膠囊可有效地調節(jié)Treg 和Th17 細胞介導的中耳炎的發(fā)生及發(fā)展，調節(jié)免疫細胞因子分泌，調節(jié)Treg/Th17 細胞失衡狀態(tài)，改善分泌性中耳炎。