張 瑞，延沁儒

（1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)理療科，陜西 西安 710000）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙疾病，主要損害運(yùn)動(dòng)、記憶、言語和認(rèn)知[1]。該病特征是在杏仁核、海馬、大腦皮層和基底節(jié)中發(fā)現(xiàn)的膽堿能神經(jīng)元變性，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成和分泌減少及β 淀粉樣蛋白（beta amyloid peptides，Aβ）沉積聚集。其中Aβ 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡可能在毒性循環(huán)中相互作用并相互擴(kuò)增，阻斷海馬突觸可塑性導(dǎo)致腦中神經(jīng)細(xì)胞逐漸死亡，引發(fā)記憶障礙[2]。據(jù)報(bào)道，AD與氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）密切相關(guān)，線粒體尤其是電子傳輸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ是產(chǎn)生和積累活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要位點(diǎn)，氧化損傷神經(jīng)元線粒體的直接結(jié)果是細(xì)胞凋亡，與AD 患者中神經(jīng)元凋亡一致[3]。目前常用于治療AD的5 種藥物只能通過改善癥狀最大限度的提高患者生活質(zhì)量[1]。AD 致病機(jī)制復(fù)雜、缺乏早期診斷和有效治療藥物等，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。因此，AD的防治仍是醫(yī)學(xué)所面臨的挑戰(zhàn)之一。丹參是一種傳統(tǒng)中草藥，常用于治療心腦血管相關(guān)疾病。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是從丹參中提取的含量最豐富和活性最高水溶性成分[4]。近年來，研究表明Sal B 具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化、調(diào)節(jié)自噬等作用，并且可以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)腦血管生成，改善腦微循環(huán)，對(duì)心腦血管疾病具有保護(hù)作用[4-6]，但臨床上有關(guān)Sal B 對(duì)AD的治療及作用機(jī)制還甚少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察Sal B 對(duì)AD小鼠模型認(rèn)知功能的影響，探究Sal B 對(duì)其凋亡的作用及機(jī)制，旨在為AD的治療提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 選擇6 月齡SPF 級(jí)昆明小鼠40 只，體重（40±3）g，購(gòu)于廣州醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SCXK 粵2013-0002），Sal B 購(gòu)于成都普菲德生物科技有限公司，D-半乳糖購(gòu)于Sigma 公司，氯化鋁（AlCl3）購(gòu)于廣州化學(xué)試劑場(chǎng)，STT-2 小鼠跳臺(tái)儀購(gòu)于北京科學(xué)院研究所，氧化指標(biāo)試劑盒購(gòu)于南京建成公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cysteine-containing aspartate-specific protease-3，Caspase-3）抗體購(gòu)于英國(guó)CST 公司，B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）抗體購(gòu)于博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建與分組干預(yù) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予飼料和超純水自由喂養(yǎng)，保持室溫20 ℃～25 ℃、濕度55%～65%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周之后，按體重大小給動(dòng)物編號(hào)，隨后利用隨機(jī)數(shù)字表連續(xù)獲得40 個(gè)數(shù)字，除以組數(shù)求余數(shù)，余數(shù)1、2、3、4 分別將動(dòng)物納入：對(duì)照組，AD 模型組，Sal B 低劑量組（salvianolic acid B low dose group，Sal B-L）和Sal B 高劑量組（salvianolic acid B high dose group，Sal B-H）；每組多于10 只的小鼠繼續(xù)以上操作，按新余數(shù)納入組別，直至每組10 只。AD 模型組給予腹腔注射濃度為120 mg/（kg·d）體積0.2 ml D-半乳糖；灌胃濃度10 mg/（kg·d）體積0.1 ml AlCl3；腹腔注射0.1 ml 生理鹽水，連續(xù)8周。Sal B 組給予腹腔注射濃度120.0 mg（kg·d）體積0.2 ml D-半乳糖，灌胃濃度10 mg（kg·d），體積0.1 ml AlCl3，此基礎(chǔ)上Sal B-L 組給予腹腔注射濃度30mg（kg·d）體積0.1 ml Sal B；Sal B-H 組給予腹腔注射濃度60 mg/（kg·d）體積0.1 ml Sal B。對(duì)照組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 最后1 次給藥后第2 天開始跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。STT-2 型小鼠跳臺(tái)儀，通電0.2 mA。先讓小鼠在跳臺(tái)儀內(nèi)適應(yīng)5.0 min，隨后給跳臺(tái)儀通電。當(dāng)其遭受電擊，正常反應(yīng)為避開電擊跳上絕緣臺(tái)。小鼠5.0 min內(nèi)從絕緣臺(tái)跳下次數(shù)，記做學(xué)習(xí)成績(jī)。第2 天相同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其5.0 min 內(nèi)第1 次從絕緣臺(tái)跳下時(shí)間，記做潛伏期。同時(shí)記錄小鼠5.0 min 內(nèi)跳下絕緣臺(tái)總次數(shù)，即錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.3 取材和處理 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h 后稱重小鼠，并在10%水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射徹底麻醉小鼠后摘眼球取血，儲(chǔ)存至抗凝EP 管。于4 ℃冰箱靜置血液4 h 后離心（3500 r/min，10 min），取上清備用。用于檢測(cè)GSH-PX、SOD 及MDA 含量。采用頸椎離斷法處理小鼠，提取腦組織。在冰凍臺(tái)上沿小鼠大腦組織的矢狀位將大腦均分為兩半，提取海馬。存放于-80 ℃冰箱，用于檢測(cè)Western Bolt 目的蛋白及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 血清樣品：取生理鹽水稀釋的血清做正式實(shí)驗(yàn)。大腦組織樣品：將海馬組織加入生理鹽水置于勻漿器，于冰上手動(dòng)勻漿1 h。隨后4 ℃離心（12000 r/min，5 min），提取上清。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定樣品中SOD 活性，MDA 及GSH-PX 含量。

1.2.5 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 冰上裂解海馬組織，提取蛋白。BCA法蛋白定量，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱導(dǎo)致蛋白變性，選取20 μg 上樣量，電泳、電轉(zhuǎn)，孵育Caspase-3、Bcl-2、Bax 抗體，4 ℃過夜；次日二抗孵育，顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)曝光，測(cè)定光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件分析，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（）表示，采取單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P≤0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠認(rèn)知功能變化比較 與對(duì)照組比較，AD 組潛伏期降低、訓(xùn)練錯(cuò)誤和記憶錯(cuò)誤次數(shù)增加（P＜0.05）；與AD 模型組比較，Sal B 各組潛伏期延長(zhǎng)、訓(xùn)練和記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少（P＜0.05）；與Sal B-L組比較，Sal B-H 組潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05）、訓(xùn)練錯(cuò)誤和記憶錯(cuò)誤次數(shù)未見明顯差異（P＞0.05），見圖1、表1。

表1 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10，）

表1 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10，）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較，#P＜0.05；與Sal B-L 組比較，▽P＜0.05

圖1 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 各組小鼠SOD、GSH-PX 活性及MDA 含量比較與對(duì)照組比較，AD 模型組小鼠腦組織及血清中GSH-PX、SOD 活性減弱，MDA 含量上升（P＜0.05）；與AD 模型組相較，Sal B 各組小鼠腦組織及血清中GSH-PX、SOD 活性增強(qiáng)，MDA 含量降低（P＜0.05）；與Sal B-L 組比較，Sal B-H 組腦組織及血清中GSH-PX、SOD 活性增強(qiáng)，MDA 含量降低（P＜0.05），見圖2、表2、表3。

表2 小鼠血清MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

表2 小鼠血清MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較，#P＜0.05；與Sal B-L 組比較，▽P＜0.05

表3 小鼠腦組織MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

表3 小鼠腦組織MDA 含量及SOD、GSH 活性變化（n=10，）

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較#P＜0.05；與Sal B-L 組比較，▽P＜0.05

圖2 小鼠氧化指標(biāo)

2.3 各組小鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，AD 模型組小鼠海馬中Bax/Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與AD 模型組比較，Sal B 各組小鼠海馬Bax/Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；Sal B-H 組Bax/Bcl-2 以及Caspase-3 蛋白表達(dá)與Sal B-L 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表4。

表4 小鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)（n=10，）

表4 小鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)（n=10，）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AD 模型組比較，#P＜0.05

圖3 小鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)情況

3 討論

D-半乳糖堆積在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)醛糖還原酶及半乳糖合成酶作用，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、線粒體空泡樣變性、功能障礙，最終引起衰老[7]；而鋁易透過血腦屏障，降低抗氧化酶水平、改變鈣穩(wěn)態(tài)、升高代謝性谷氨酸受體表達(dá)等，破壞突觸可塑性、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡從而損害學(xué)習(xí)記憶水平[8]。本實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)期高濃度氯化鋁灌胃聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖建立復(fù)合AD 小鼠模型[9]，結(jié)果顯示相較于正常對(duì)照組，AD 模型組小鼠出現(xiàn)脊柱前凸、脫毛、活動(dòng)遲緩；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，AD 模型組小鼠發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙。此模型取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可信度。

線粒體功能障礙在Aβ 沉積聚集或記憶障礙的發(fā)展之前就發(fā)現(xiàn)了裂變、融合和功能異常，具體反映在ROS 水平升高，Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞，脂質(zhì)過氧化以及細(xì)胞凋亡上[1，10]?？寡趸芰Φ慕档椭苯佑绊懮窠?jīng)元的突觸活動(dòng)和神經(jīng)傳遞，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[10]。受ROS 影響的分子靶標(biāo)包括核和線粒體DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、受體運(yùn)輸和內(nèi)吞作用以及能量穩(wěn)態(tài)。反之，異常的細(xì)胞代謝會(huì)影響Aβ 和磷酸化tau 蛋白的產(chǎn)生和積累，從而獨(dú)立加劇線粒體功能障礙和ROS的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。在正常情況下，充當(dāng)自由基清除劑的抗氧化劑酶介導(dǎo)ROS的水平，包括SOD 和GSH-PX；同時(shí)ROS 可將多不飽和脂肪酸氧化為過氧化脂肪酸，后者進(jìn)行重排并進(jìn)一步反應(yīng)以形成多種次級(jí)氧化產(chǎn)物，如MDA，進(jìn)而影響線粒體呼吸鏈中關(guān)鍵酶的活性，嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜[4]。以上指標(biāo)均用于評(píng)估氧化應(yīng)激反應(yīng)程度。線粒體在細(xì)胞中還具有調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡或凋亡作用。據(jù)報(bào)道[1]，通過TUNEL 染色評(píng)估，與健康的大腦相比，AD 大腦中的神經(jīng)元顯示出凋亡的標(biāo)志。Bcl-2家族的抗凋亡和促凋亡成員之間的均衡參與并維持線粒體完整性，Bcl-2 與Bax的比值對(duì)細(xì)胞存活和死亡至關(guān)重要。Bcl-2 在抑制凋亡、損傷后修復(fù)等方面有重要意義；Bax 可改變線粒體外膜通透性，促使細(xì)胞色素-C 從線粒體釋放到胞質(zhì)，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)源性凋亡。細(xì)胞凋亡遵循與腫瘤壞死因子受體家族成員相關(guān)的外源性途徑，同樣遵循與從線粒體中釋放細(xì)胞色素C的內(nèi)源性途徑；兩種途徑最終在半胱氨酸天冬氨酸酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端部分合并。級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最后一步是激活Caspase-3，促使細(xì)胞內(nèi)蛋白水解，細(xì)胞骨架崩潰和DNA 片段化。因此，Caspase-3 被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的通用指標(biāo)[11]。

Sal B 是天然有效的抗氧化劑，含有9 個(gè)酚羥基，因此它可以提供許多氫原子以發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用，通過抑制聚（ADP-核酶）聚合酶1（PARP-1）活性以防止NAD+消耗、上調(diào)Grx1 表達(dá)，從而有效抑制ROS的產(chǎn)生并減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA的產(chǎn)生，以發(fā)揮抗氧化作用[4]。有研究表明[12]，Sal B可顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞體外損傷，并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化；還能夠改善小鼠暫時(shí)性腦缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)與記憶功能障礙。同時(shí)，Sal B 可以通過降低細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣濃度來降低Caspase-3 活性，減少皮層神經(jīng)元和肝細(xì)胞等細(xì)胞凋亡[13]。Yu X等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SalB 治療激活了AKT/CREB/BDNF信號(hào)通路，抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮抗驚厥作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與AD 模型組比較，Sal B 增加小鼠腦組織和血清中SOD、GSH-PX 含量，減少M(fèi)DA 含量，增加小鼠海馬Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，減少Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)，表明Sal B 可能通過調(diào)節(jié)OS 反應(yīng)中相關(guān)酶的活性改善氧化損傷，繼而減輕線粒體損傷，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Bcl-2 與Bax 比值，抑制Caspase-3 凋亡蛋白表達(dá)，改善小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，Sal B 對(duì)AD 小鼠的認(rèn)知功能具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善OS 損傷從而減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)。說明Sal B 可能是治療神經(jīng)退行性疾病的有效藥物。在臨床試驗(yàn)之前，仍需要進(jìn)一步研究來驗(yàn)證Sal B 對(duì)抗其他AD 模型通過其他靶點(diǎn)的抗老年癡呆作用。