王興益, 陳彥龍, 李攻科

(1. 中山大學化學學院, 廣東 廣州 510275; 2. 興義民族師范學院生物與化學學院, 貴州 興義 562400)

丁香酚作為一種漁用麻醉劑,在水產(chǎn)品長途運輸中,可降低呼吸和代謝強度,減少碰撞,降低其死亡率而被廣泛使用[1]。但有研究表明,高劑量的丁香酚會引起心律失常、腎臟損傷、消化系統(tǒng)等問題,對人類健康造成潛在危害[2],因此日本食品安全法規(guī)定丁香酚在水產(chǎn)品體內(nèi)的最大殘留量為50 μg/kg[3],但我國還未對其使用和殘留量制定相關(guān)法規(guī),針對其在水產(chǎn)品中的痕量殘留檢測的文獻報道較少。目前,丁香酚類麻醉劑常用的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)[4-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)[8]、高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)[9,10]和電化學(EC)[11]等,但水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑含量少,基質(zhì)復雜,對其進行準確檢測存在一定困難。高效的樣品前處理方法是獲得準確結(jié)果的有效方法,現(xiàn)有液液萃取(LLE)[9]、固相萃取(SPE)[4]、分散固相萃取(DSPE)[8]和固相微萃取(SPME)[7,12]等方法應(yīng)用在水產(chǎn)品前處理中,其中LLE方法操作簡單,但很難消除水產(chǎn)品中色素、脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)對測定的干擾,DSPE方法在處理過程中容易造成目標物損失導致回收率偏低,所以SPE和SPME技術(shù)在水產(chǎn)品前處理中更為常用,特別是針對水產(chǎn)品中一些揮發(fā)性和痕量物質(zhì)檢測時,SPME技術(shù)因其高效低耗、綠色環(huán)保顯示出更大的優(yōu)勢而被廣泛使用[13]。

SPME涂層是決定方法選擇性、靈敏度、壽命、重現(xiàn)性和應(yīng)用價值的關(guān)鍵。SPME涂層的種類有限,其萃取容量或選擇性難以滿足不同性質(zhì)復雜樣品的痕量分析要求,亟待發(fā)展新型SPME涂層[14]。氟化共價有機聚合物(fluorinated covalent organic polymer, F-COP)是一類具有拓撲結(jié)構(gòu)的新型多孔聚合材料,主要由輕質(zhì)原子通過較強的共價鍵相互連接而成,具有物理化學性質(zhì)穩(wěn)定、吸附容量高、孔結(jié)構(gòu)和尺寸可控等特點,而且F-COP結(jié)構(gòu)中含有氟官能團,可以與酚羥基之間形成氫鍵相互作用,從而實現(xiàn)對目標物的特異性識別與吸附,因此F-COP吸附劑在丁香酚類化合物的富集與分析中有很大的應(yīng)用潛力[15-17]。

本文以三氟甲磺酸鈧為催化劑,在室溫下合成一種F-COP材料,并采用黏合法在石英棒表面制備SPME涂層,結(jié)合HPLC-UV建立了測定丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚的分析方法,并將該方法成功應(yīng)用到羅非魚和基圍蝦的分析中,為水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的殘留檢測提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

LC-2010島津液相色譜儀(日本島津); H1850臺式高速離心機(湖南湘儀); DZF-6020真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司); GZX-9146鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠); DF-101S恒溫加熱攪拌器(鞏義予華儀器有限責任公司); KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Nicolet Magna 750傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet); Gemini SEM 500場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國Zeiss); D8 Advance X射線衍射儀(德國Bruker); ASAP 2020全自動氣體吸附儀(美國Micromeritics)。

2,3,5,6-四氟對二苯甲醛(TFA, 純度98%)、1,3,5-三(4-氨苯基)苯(TAPB, 純度97%)、三氟甲磺酸鈧(Sc(OTf)3, 純度99%)(畢得醫(yī)藥);丁香酚(純度98%)、乙酸丁香酚酯(純度98%)、甲基丁香酚(純度98%)的標準品、1,4-二氧六環(huán)(無水級,純度99.5%)(北京百靈網(wǎng)科技有限公司); 1,3,5-三甲苯(無水級,純度97%)(阿拉丁試劑(上海)有限公司);聚丙烯腈(PAN,平均相對分子質(zhì)量150 000)(分析純,美國Sigma-Aldrich公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鈉、鹽酸、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃(分析純,天津市大茂化學試劑廠);甲醇、乙醇、乙腈和丙酮(色譜純,Dikma公司);石英棒(外徑920 μm,純度99.99%)(富友石英制品廠);實驗中所用超純水均為Milli-Q制備。

1.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil Plus C18-B(250 mm×4.6 mm, 5 μm);紫外檢測波長:280 nm;流動相:甲醇-水(60∶40, v/v);流速:0.800 mL/min;進樣量:20.0 μL;柱溫:30 ℃。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取10.0 mg(精確至0.2 mg)丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚標準品,用色譜純甲醇配制成400 mg/L的混合標準儲備液,于4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆?。實驗所需不同濃度溶液均用超純水進行稀釋。

1.4 F-COP-SPME石英棒的制備

1.4.1F-COP材料的制備

根據(jù)文獻[18,19]報道的合成方法并進行適當修改,制備F-COP材料。具體合成方法如下:稱取TAPB (36 mg)和TFA (31 mg),加入4 mL的1,4-二氧六環(huán)-1,3,5-三甲苯(4∶1, v/v)混合溶液,超聲至完全溶解。在超聲條件下緩慢加入2 mg Sc(OTf)3催化劑,室溫下密封靜置反應(yīng)10 min,得到黃色固體物質(zhì),分別用1,4-二氧六環(huán)和甲醇超聲洗滌3次(3×10 mL),然后離心分離,獲得的材料在60 ℃真空條件下干燥12 h備用。

1.4.2F-COP-SPME石英棒的制備

截取5 cm石英棒,依次用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸溶液各浸泡5 h,再用超純水超聲清洗后于100 ℃下烘干備用。采用黏合法制備F-COP-SPME石英棒,具體過程如下[12]: (a)分別稱取90 mg F-COP粉末和90 mg PAN粉末于3 mL玻璃小瓶中,加入1.5 mL DMF,放入小磁子攪拌,超聲分散形成均勻漿液;(b)將石英棒插入漿液中,再從漿液中緩慢拉出,置于空氣中晾干1 min,再放入80 ℃烘箱中加熱30 min,重復此操作2次;(c)將涂覆后的石英棒放入150 ℃烘箱中老化2 h; (d)老化后的石英棒涂層分別用10 mL丙酮、甲醇和超純水各超聲清洗10 min; (e)用刀片小心刮去多余涂層,保留涂層的長度為2.0 cm,最終得到SPME石英棒。F-COP-SPME石英棒每次使用前用10 mL甲醇和10 mL超純水各清洗10 min后再進行萃取。

1.5 樣品前處理

鮮活羅非魚和基圍蝦購于廣州當?shù)厮a(chǎn)品市場,將其洗凈去除魚鱗、蝦皮和內(nèi)臟,然后用組織勻漿機絞碎樣品,放入-20 ℃下保存待分析。稱取2.00 g樣品放入50 mL離心管中,加入5 mL乙腈和5.00 g硫酸鈉后,依次渦旋振蕩和超聲各10 min,再以5 000 r/min速度離心10 min,移取上層清液至另一支離心管中,殘渣按上述步驟重復提取一次,合并兩次上清液,加入5 mL正己烷脫脂,渦旋振蕩10 min,靜置10 min,去除上層正己烷相,將剩余溶液在室溫下氮氣吹干,加3.00 mL超純水重溶,得到樣品溶液。

1.6 F-COP-SPME萃取過程

將3.00 mL樣品溶液置于4 mL帶密封墊的樣品瓶中,插入制備的F-COP-SPME石英棒,涂層需全部侵入樣品溶液中,室溫下攪拌萃取(700 r/min) 30 min。然后將石英棒立即放入加有500 μL乙腈解吸液的小瓶中,超聲解吸10 min,解吸液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待HPLC-UV分析。F-COP-SPME石英棒每次使用后,用10 mL甲醇和10 mL超純水各清洗3次后待下次使用。

1.7 模擬計算

通過Gaussian 09和Discovery Studio軟件,在密度泛函理論方法優(yōu)化結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,計算丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚與所制備F-COP材料間的吸附能和電子云分布情況[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 F-COP-SPME石英棒的設(shè)計與制備

SPME涂層的制備方法主要有:物理沉積法[17]、溶膠-凝膠法[21]、化學鍵合法[22]、電化學法[23]、原位生長[24]和黏合法[12,25]等。其中,黏合法具有更好的通用性,適用于制備不同類型材料的SPME涂層。PAN作為一種黏合劑,除具有較好的生物相容性外,還有較高的化學和機械穩(wěn)定性,適用于生物樣品中活性物質(zhì)的SPME[12,25]。F-COP結(jié)構(gòu)中的F可以與丁香酚中的-OH基團形成氫鍵相互作用,所以F-COP對丁香酚類化合物具有特異性吸附作用。因此,本文以F-COP為吸附材料,以PAN為黏合劑制備了性能良好的F-COP-SPME石英棒,并將該石英棒用于水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的分析檢測。制備及其應(yīng)用過程見圖1。

圖1 氟化共價有機聚合物固相微石英棒的制備及其應(yīng)用Fig. 1 Preparation and application of the F-COP-SPME bar TAPB: 1,3,5-tris(4-aminophenyl)benzene; TFA: 2,3,5,6-tetrafluoroterephthalaldehyde; Sc(OTf)3: scandium (Ⅲ) triflate; F-COP: fluorinated covalent organic polymer.

2.2 F-COP-SPME石英棒結(jié)構(gòu)性能表征

通過傅里葉紅外光譜(見圖2a)來確定F-COP的特征官能團。從F-COP曲線可以看出,在1 601 cm-1處存在較強吸收峰,為席夫堿反應(yīng)生成的F-COP骨架中C=N的特征伸縮振動峰[26],從TAPB曲線中能找到N-H(3 433、3 351、3 209 cm-1)和C-N (1 279 cm-1)的伸縮振動峰;從TFA曲線中很明顯地看到1 704 cm-1的C=O的特征吸收峰,1 485 cm-1的C-C和1 297 cm-1的C-F伸展振動峰。這些結(jié)果表明通過TAPB與TFA的縮合反應(yīng)成功合成了F-COP材料。

通過X射線衍射方法探究了F-COP的晶型結(jié)構(gòu)。從圖2b可以看出,F-COP的X射線衍射圖中有一個寬反射峰,說明合成的F-COP是非晶態(tài)聚合物。

F-COP材料的N2吸附-解吸等溫線如圖2c所示,根據(jù)IUPAC的分類標準,屬于典型的Ⅳ型,表明F-COP具有介孔特性,在低壓段N2吸附量很快上升至較高值,說明材料中還存在微孔結(jié)構(gòu),這與孔徑分布曲線(如圖2c的內(nèi)插圖)顯示的F-COP材料的平均孔徑為3.69 nm的結(jié)果相一致。采用非局部密度泛函理論計算得到F-COP材料的比表面積和孔體積分別為35 m2/g和0.12 cm3/g。

圖2 (a) F-COP、TAPB和TFA的傅里葉紅外光譜圖, (b) F-COP的X射線衍射圖, (c) F-COP的N2吸附-解吸等溫線和孔徑分布圖, (d-f) F-COP-SPME石英棒的掃描電鏡圖Fig. 2 (a) Fourier transform infrared spectra of the F-COP, TAPB, and TFA, (b) X-ray diffraction pattern of theF-COP, (c) N2 adsorption-desorption isotherms and pore size distribution of the F-COP, and (d-f) scanning electron micrographs of the F-COP-SPME barMagnifications: d. 90×; e. 110×; f. 1500×.

通過掃描電鏡對F-COP-SPME石英棒表面形貌進行表征。如圖2d可見,石英棒表面粗糙、多孔,這種結(jié)構(gòu)能增加涂層與樣品之間的接觸面積,提高樣品的萃取容量。此外,從F-COP-SPME石英棒的橫截面(圖2e和f)看出,涂層緊密地涂覆在石英表面上,厚度約為50 μm,說明制備的石英棒牢固,可以多次重復使用。

2.3 F-COP-SPME石英棒的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

分別取同一批次和不同批次制備的F-COP-SPME石英棒,對50 μg/L的混合標準溶液(丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚)重復萃取5次,考察石英棒萃取性能的重現(xiàn)性。實驗結(jié)果顯示,同一批次和不同批次制備的F-COP-SPME石英棒之間,丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚峰面積的相對標準偏差(RSD)分別小于6.3%和8.7%,表明自制F-COP-SPME石英棒具有較好的制備重現(xiàn)性。

將F-COP-SPME石英棒分別浸泡于水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和四氫呋喃中超過24 h,均未發(fā)現(xiàn)涂層有溶脹和開裂的現(xiàn)象,表明涂層的溶劑耐受性良好。

用同一根F-COP-SPME石英棒對50 μg/L丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚的混合標準溶液重復萃取10次,萃取峰面積的RSD小于4.8%,且涂層也沒有明顯的溶脹和脫落現(xiàn)象,表明自制F-COP-SPME石英棒的穩(wěn)定性較好。

2.4 萃取條件優(yōu)化

將制備的F-COP-SPME石英棒用于丁香酚類麻醉劑的萃取,考察石英棒的萃取性能。為獲得最佳的萃取量,對影響萃取量的幾個重要條件(萃取時間、攪拌速度、解吸溶劑及解吸時間)進行了優(yōu)化。實驗過程中,以萃取體積為3.00 mL,質(zhì)量濃度為500 μg/L的目標物混合標準溶液考察優(yōu)化條件,結(jié)果見圖3。

2.4.1萃取時間

SPME是一個平衡吸附過程,萃取量與萃取時間有著密切關(guān)系。實驗考察了萃取時間(5～60 min)對SPME萃取量的影響。從圖3a中可以看出,隨著萃取時間的延長,3種麻醉劑的萃取量在30 min時基本達到了吸附平衡。隨著萃取時間的進一步增加,萃取量沒有明顯增加。因此,為了提高樣品前處理效率,選擇30 min作為萃取時間。

2.4.2攪拌速度

攪拌可以加速分析物從樣品溶液向F-COP-SPME石英棒的擴散,縮短吸附平衡時間。實驗中考察了不同攪拌速度下3種麻醉劑的萃取量(圖3b)。實驗發(fā)現(xiàn),當攪拌速度達到700 r/min時,萃取率最大。繼續(xù)增加攪拌速度,萃取率變化不明顯,逐漸趨于平緩。所以,SPME萃取中選擇攪拌速度為700 r/min。

2.4.3解吸溶劑

解吸溶劑的選擇對解吸量有很大影響,良好的解吸溶劑可以最大限度地將目標物從石英棒上洗脫下來。實驗中,選擇了常見的甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯溶劑作為解吸溶劑進行研究。結(jié)果如圖3c所示,在相同的萃取和洗脫條件下,乙腈的解吸效果最好。因此,選擇乙腈為最佳解吸溶劑。

2.4.4解吸時間

為了實現(xiàn)3種麻醉劑最大程度的洗脫,實驗考察了不同時間段中解吸量的變化,結(jié)果如圖3d所示,3種麻醉劑的洗脫量在10 min基本達到最大值。因此,選擇10 min為解吸時間。

2.5 吸附機理

F-COP具有富苯環(huán)和共軛雙鍵的高交聯(lián)結(jié)構(gòu),可以與丁香酚類化合物分子形成π-π堆疊作用。此外,采用分子模擬計算(Gaussian 09),探究了F-COP與丁香酚類化合物分子之間的吸附機理[17,27]。F-COP結(jié)構(gòu)中的-F可以與丁香酚類化合物之間形成F…O-H氫鍵,提高目標分子的吸附能力,F-COP的這些特性使其成為優(yōu)良的SPME介質(zhì)。分子模擬發(fā)現(xiàn),丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚均穩(wěn)定地存在于F-COP空腔結(jié)構(gòu)中(見圖4)。從圖4a可知,丁香酚可以與F-COP骨架結(jié)構(gòu)中的N和F形成氫鍵,氫鍵鍵長分別為0.191和0.232 nm,兩種氫鍵的共同作用,使得F-COP與丁香酚之間有較強的吸附,其吸附能為49.9 kJ/mol。相比于丁香酚,F-COP與乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚之間不存在氫鍵相互作用,因此吸附較弱,其吸附能分別為17.9和19.4 kJ/mol。在此基礎(chǔ)上,利用Discovery Studio軟件模擬計算了F-COP與丁香酚類化合物分子之間的電子云分布。從圖4d和f可知,F-COP與丁香酚和甲基丁香酚之間存在電荷轉(zhuǎn)移,因此主客體分子間吸附較強。從圖4e可知,F-COP與乙酸丁香酚酯之間幾乎不存在電荷轉(zhuǎn)移,因此主客體分子間吸附較弱。上述的模擬計算結(jié)果與實驗結(jié)果吻合,即F-COP與丁香酚之間識別能力最高,甲基丁香酚次之,乙酸丁香酚酯最弱。

圖4 F-COP與目標分子間吸附能力及電子云分布理論模擬圖Fig. 4 Theoretical simulation of the adsorption ability and electron cloud distribution of the F-COP toward objectsa,d. eugenol; b,e. eugenyl acetate; c,f. methyl eugenol.

2.6 方法的驗證

在優(yōu)化的萃取條件下,探究了3種丁香酚類麻醉劑的線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)及檢出限(LOD)等性能參數(shù)。結(jié)果如表1所示,丁香酚和乙酸丁香酚酯在10～1 000 μg/L,甲基丁香酚在10～1 500 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,r2大于0.996 1。3種丁香酚類麻醉劑的LOD(S/N=3)在2.9～4.5 μg/kg之間,該法的檢出限可以滿足日本和歐盟等國家對丁香酚類麻醉劑在水產(chǎn)品體內(nèi)殘留最高限量為50 μg/kg的檢測要求。

表1 F-COP-SPME-HPLC-UV檢測3種丁香酚類麻醉劑的方法性能參數(shù)

與文獻報道的水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的檢測方法相比,本研究建立的方法的檢出限較低,可以滿足水產(chǎn)品中丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3種麻醉劑殘留的同時檢測。幾種方法的線性范圍和檢出限見表2。

表2 本方法與文獻報道的水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑檢測方法比較

2.7 實際樣品分析及加標回收率試驗

采用所建立的F-COP-SPME-HPLC-UV方法對羅非魚和基圍蝦樣品進行分析檢測,在羅非魚樣品中檢測出丁香酚含量為101 μg/kg,超出了日本和歐盟等國家對丁香酚類麻醉劑在水產(chǎn)品體內(nèi)殘留限量為50 μg/kg的標準。實際樣品的相關(guān)譜圖見圖5。

圖5 羅非魚和基圍蝦樣品的HPLC-UV圖Fig. 5 HPLC-UV chromatograms of tilapia and shrimp samples a. direct injection of sample solution; b. sample solution extracted by the F-COP-SPME bar; c. spiked sample solution (100 μg/kg) extracted by the F-COP-SPME bar.

采用在實際樣品中加標驗證方法的可靠性,加標水平分別為50和100 μg/kg。3種麻醉劑在兩種樣品中的加標回收率分別為76.7%～98.7%和80.3%～104%, RSD分別為8.5%～11.8%和8.6%～12.4%(見表3),表明所建立方法具有良好的精密度和準確度,可以滿足實際水產(chǎn)品中丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚類麻醉劑殘留的分析要求。

表 3 3種丁香酚類麻醉劑在水產(chǎn)品中的加標回收率及RSD(n=5)

3 結(jié)論

本研究制備了新型氟化共價有機聚合物,將其作為SPME石英棒涂層吸附劑,制備了F-COP-SPME石英棒,結(jié)合HPLC-UV建立了測定丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚的分析方法,并將該方法成功地應(yīng)用到水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的殘留檢測中,方法操作簡單,線性范圍寬,檢出限低,適用于水產(chǎn)品中丁香酚、乙酸丁香酚酯和甲基丁香酚3種麻醉劑殘留的同時分析。