李雯卉， 劉輝， 李澤燁， 韋佳祎， 陳譽(yù)華

血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)，它緊密地控制著離子、分子、細(xì)胞在血管和腦之間運(yùn)動(dòng)[1]。血腦屏障的屏障特性是使神經(jīng)組織免受毒素和病原體的侵襲，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要[1-2]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障重要的細(xì)胞組分，它在血腦屏障的建立以及功能發(fā)揮中起關(guān)鍵作用[3-4]。許多研究還發(fā)現(xiàn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙與很多腦血管相關(guān)疾病有緊密的聯(lián)系[5-9]。1992年，Atg7因其在酵母自噬中發(fā)揮重要作用而開始被關(guān)注[10]，隨后它一些新的功能也陸續(xù)被研究者發(fā)現(xiàn)。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞敲除Atg7能減弱動(dòng)脈血栓的形成[11]，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞敲除Atg7不利于腦血管的形成[12]。然而，Atg7在腦血管和參與血腦屏障形態(tài)建成的機(jī)制尚不清楚。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌形成的一種免疫防御系統(tǒng)，近年來(lái)經(jīng)人為改造后廣泛應(yīng)用于基因編輯，其原理是通過(guò)單一引導(dǎo)RNA序列(sgRNA)識(shí)別特定靶DNA序列，將內(nèi)切酶Cas9引導(dǎo)至靶DNA的設(shè)定位置進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞在通過(guò)自身非同源性末端修復(fù)時(shí)，可使目標(biāo)區(qū)域DNA出現(xiàn)插入、缺失等改變，達(dá)到基因敲除或改造的目的[13]。我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)在體外構(gòu)建Atg7基因敲除的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，為Atg7在腦血管的發(fā)育和參與血腦屏障形態(tài)建成的機(jī)制以及腦血管相關(guān)疾病的深入研究提供體外細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)(美國(guó)Johns Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院K.S.Kim教授贈(zèng)送)；1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶、嘌呤霉素(Gbicol，美國(guó))；NU血清(BD，美國(guó))；殺稻瘟菌素、atg7抗體(Sigma，美國(guó))；H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3Flag-espCas9_1.1；H6804 pLenti-U6-spgRNAv2.0-CMV-Blasticidin質(zhì)粒；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase；TaKaRa TaqTMVer. 2.0 plus dye；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0；和元無(wú)縫克隆試劑盒；DH5α感受態(tài)細(xì)胞；luria-bertani(LB)培養(yǎng)基；AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司，DP117，北京)；TRNzol Universal總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司，DP424，北京)；FastKing RT Kit(With gDNase)(天根生化科技有限公司，KR116，北京)；熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)(天根生化科技有限公司，F(xiàn)P209，北京)；放射免疫沉淀測(cè)定細(xì)胞裂解液(碧云天，美國(guó))；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、冷凍高速離心機(jī)(Thermo Fisher，美國(guó))；β-actin單克隆抗體(中杉金橋，中國(guó))；山羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗(賽默飛世爾，中國(guó))；DNA電泳槽、穩(wěn)壓電泳儀(上海天能科技有限公司)；凝膠成像分析儀(培清科技)；超微量分光光度計(jì)(北京奧凱科技發(fā)展有限公司)；移液器(Eppendorf，德國(guó))；電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(Applied biosystems，美國(guó))；7500 Real Time PCR擴(kuò)增儀(ABI，美國(guó))；雙光子激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國(guó))。本研究的引物合成，sgRNA的合成以及病毒包裝均由和元生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.2 sgRNA的設(shè)計(jì)和合成 利用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具(http：//crispr.mit.edu)，在人Atg7基因(GeneID:10533)的第一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)2對(duì)sgRNA(表1)，分別為sgRNA1(針對(duì)的靶點(diǎn)序列AGA AGA AGC TGA ACG AGT ATC GG)、sgRNA2(針對(duì)的靶點(diǎn)序列TAG GGT CCA TAC ATT CAC TGA GG)；分別在sgRNA的正義鏈(F)的5’端添加ACCG、反義鏈(R)的5’端添加AAAC形成黏性末端，可與BsmBI酶酶切后的黏性末端互補(bǔ)。

表1 CRISPR/Cas9敲除HBMEC Atg7基因sgRNA引物序列

1.3 重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶BasmBI對(duì)表達(dá)載體H6804進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒2 μg，10×反應(yīng)Buffer 5 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，用水補(bǔ)足50 μL，于37 ℃水浴鍋中孵育2 h以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，從瓊脂糖凝膠電泳切割目的載體條帶，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，得到質(zhì)粒H6804的線性載體。使用無(wú)縫克隆試劑盒將sgRNA與H6804的線性載體連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體H6840-sgRNA1(Y7541)和H6840-sgRNA2(Y7542)，分別將它們轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞均勻涂到含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，第二天挑取單菌落，搖菌培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR，菌落鑒定得到的陽(yáng)性克隆，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，正向測(cè)序引物hU6-F2 TAC GAT ACA AGG CTG TTA GAG AG，反向測(cè)序引物pY-SEQR CTA TTA ATA ACT AAT GCA TGG C。軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果并分析。測(cè)序通過(guò)的陽(yáng)性克隆，安排質(zhì)粒小提并進(jìn)行雙酶切再一次驗(yàn)證。

1.4 HBMEC的培養(yǎng)以及嘌呤霉素及殺稻瘟菌素篩選濃度的確定 用NU培養(yǎng)基(含10%NU血清、10%胎牛血清和細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分的1640培養(yǎng)液)培養(yǎng)細(xì)胞。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種1.5×105的細(xì)胞量，第二天分別用嘌呤霉素濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 mg/L的NU培養(yǎng)基或殺稻瘟菌素濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 mg/L的NU培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基。每個(gè)抗生素的每個(gè)濃度都設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，總共72個(gè)孔。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，選擇7 d使細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為它們的篩選濃度。最后確定嘌呤霉素的篩選濃度為1 mg/L，殺稻瘟菌素的篩選濃度為3 mg/L。

1.5 慢病毒包裝和感染HBMEC以及敲除Atg7基因的HBMEC的單克隆篩選 H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3Flag-espCas9_1.1、H6840-sgRNA1(Y7541)和H6840-sgRNA2(Y7542)三個(gè)真核表達(dá)載體分別和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。之后對(duì)包裝好的病毒進(jìn)行滴度檢測(cè)。培養(yǎng)HBMEC，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于2個(gè)35 mm培養(yǎng)皿，每個(gè)皿接種5×105的細(xì)胞量，第二天其中一個(gè)培養(yǎng)皿加入Cas9病毒，所加病毒量根據(jù)病毒滴度、細(xì)胞量和選擇的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值計(jì)算[病毒量(μL)=MOI×感染時(shí)的細(xì)胞數(shù)/滴度(TU/mL)×1 000]。病毒感染12～16 h后更換為新的NU培養(yǎng)基。另一個(gè)培養(yǎng)皿不加病毒，作為加Cas9病毒的對(duì)照組。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行細(xì)胞傳代，Cas9病毒感染的細(xì)胞傳至4個(gè)35 mm培養(yǎng)皿，分別編號(hào)為1、2、3、4，用含1 mg/L嘌呤霉素的NU培養(yǎng)基培養(yǎng)。未感染Cas9病毒的正常HBMEC統(tǒng)一保留一個(gè)35 mm培養(yǎng)皿，編號(hào)為5，用正常的NU培養(yǎng)基培養(yǎng)。4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)皿中細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，用來(lái)提取蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cas9。1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)皿中分別加入H6840-sgRNA1(Y7541)和H6840-sgRNA2(Y7542)病毒感染細(xì)胞，感染過(guò)程與Cas9病毒感染細(xì)胞相同。感染48 h后消化離心收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過(guò)有限稀釋法最后把細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種1個(gè)細(xì)胞，各接種48個(gè)孔，進(jìn)行單克隆篩選。接種96孔板后剩下的細(xì)胞傳至60 mm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)的培養(yǎng)液用含1 mg/L的嘌呤霉素和3 mg/L的殺稻瘟菌素的NU培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后凍存?zhèn)溆谩?6孔板中細(xì)胞第二天也換成1 mg/L的嘌呤霉素和3 mg/L的殺稻瘟菌素的NU培養(yǎng)基。每天觀察孔中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并做好標(biāo)記。培養(yǎng)5 d后每隔1天對(duì)有細(xì)胞的孔進(jìn)行換液，大約14 d后待孔中細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，轉(zhuǎn)移至24孔板中，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后依次傳至6孔板、培養(yǎng)瓶中。對(duì)挑選出來(lái)的單克隆細(xì)胞都仔細(xì)做好標(biāo)號(hào)。3號(hào)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞(只感染了Cas9病毒的細(xì)胞，HBMEC-cas9)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存一部分，其作為我們挑選出來(lái)的單克隆細(xì)胞(HBMEC-atg7KO)的對(duì)照細(xì)胞。

1.6 HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7 mRNA的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Atg7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。收集HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO,通過(guò)TRNzol Universal總RNA提取試劑提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞的Atg7 mRNA。引物序列見表2。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸32 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct計(jì)算Atg7的mRNA相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t=(CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照組目的基因-CT對(duì)照組內(nèi)參基因)。

表2 人Atg7基因和GAPDH基因引物序列

1.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白 采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Atg7蛋白，以β-actin作為內(nèi)參。收集HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，用含苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測(cè)定細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，裂解30 min后用細(xì)胞刮收集到離心管中，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min(離心半徑20 cm)，上清液即為提取的蛋白質(zhì)。通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，加入5×蛋白上樣緩沖液制成蛋白樣，制成的蛋白樣99 ℃加熱5 min。之后即可進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加一抗(Atg7 1∶1 000；β-actin 1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，第二天Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3×10 min，二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3×10 min，化學(xué)發(fā)光，觀察蛋白的表達(dá)情況。

1.8 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白 分別將HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO接種于孔中已提前放好蓋玻片的6孔板中，各孔接種2×105的細(xì)胞量，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后取出細(xì)胞進(jìn)行染色。去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室溫固定10 min；固定后用預(yù)冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；用0.1%的Triton X-100室溫透化處理1 min，預(yù)冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；加入1%的牛血清白蛋白室溫封閉1 h；封閉結(jié)束后加入鼠抗人Atg7一抗(1∶100,用1%牛血清白蛋白稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；第二天用預(yù)冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶200,用1%牛血清白蛋白稀釋)，室溫孵育1 h；1 h后用預(yù)冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min，之后進(jìn)行細(xì)胞核染色(1 g/L的4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)用PBS按1∶1 000稀釋)，染色3 min；預(yù)冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；加入防淬滅的封固劑進(jìn)行封固，共聚焦顯微鏡照相觀察。

1.9 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 在35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)正常HBMEC、HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO，在倒置顯微鏡下觀察3種細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄，分析敲除Atg7后細(xì)胞形態(tài)是否出現(xiàn)變化。

2 結(jié)果

2.1 重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA的構(gòu)建情況 各挑取8個(gè)含重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA1(Y7541)或H6804-sgRNA2(Y7542)的單菌落搖菌后進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，均可見清晰條帶。同時(shí)基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA1相對(duì)質(zhì)粒H6840插入了一段序列,sgRNA1-F序列一致；重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA2相對(duì)質(zhì)粒H6840插入了一段序列,與sgRNA2-R序列一致。以上結(jié)果表明，重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA1、H6804-sgRNA2構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 重組真核表達(dá)載體H6804-sgRNA的構(gòu)建

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7 mRNA的相對(duì)表達(dá) 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Atg7的mRNA，結(jié)果顯示，Atg7基因敲除的HBMEC Atg7 mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7 mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.3 蛋白免疫印跡檢測(cè)HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白的表達(dá) 通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的Atg7基因敲除的HBMEC Atg7蛋白的表達(dá)完全消失。見圖3。

圖3 HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白的檢測(cè)

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白的表達(dá) 利用免疫熒光染色觀察HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白，結(jié)果表明HBMEC-atg7KO組與對(duì)照組HBMEC-Cas9相比Atg7的表達(dá)明顯減少。見圖4。

圖4 免疫熒光染色觀察Atg7的表達(dá)

2.5 光鏡下HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO的細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO細(xì)胞，在光鏡下觀察它們的形態(tài)，Atg7敲除組與對(duì)照組相比，未見有明顯的細(xì)胞形態(tài)改變。見圖5。

圖5 細(xì)胞形態(tài)的觀察(×10)

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在1987年由Ishino等[14]發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)成為生物學(xué)家和遺傳學(xué)家最強(qiáng)大的工具之一。從2012年CRISPR/Cas9首次證明可以在體外進(jìn)行DNA切割以來(lái)，該系統(tǒng)因?yàn)槠浔鹊谝淮鶽FN和第二代TALEN基因編輯技術(shù)操作更為簡(jiǎn)單、修飾更為精確、效率更為高效、成本更低等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用[15]。該系統(tǒng)通過(guò)gRNA和Cas9蛋白可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因DNA的識(shí)別和編輯；除了對(duì)單個(gè)堿基編輯外，我們可設(shè)計(jì)多個(gè)不同的gRNA介導(dǎo)Cas9蛋白同時(shí)進(jìn)行多基因的編輯。

自噬中的關(guān)鍵基因Atg7作為研究的焦點(diǎn)，在發(fā)育、維系健康和控制疾病中發(fā)揮重要作用[16]。在前期研究中，在體實(shí)驗(yàn)我們構(gòu)建了內(nèi)皮特異性敲除Atg7的小鼠；而體外實(shí)驗(yàn)我們只能選擇RNAi技術(shù)瞬時(shí)敲減Atg7。由于RNAi技術(shù)只能短時(shí)間內(nèi)使Atg7基因的表達(dá)下調(diào)，這極大的限制了我們對(duì)該基因功能的研究，而CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用使得這一問(wèn)題迎刃而解。本研究中我們針對(duì)人Atg7基因第一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)了2對(duì)sgRNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，與Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到HBMEC中，實(shí)現(xiàn)對(duì)HBMEC細(xì)胞進(jìn)行Atg7基因的敲除。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光染色證明了我們?cè)贖BMEC細(xì)胞中成功敲除了Atg7基因。通過(guò)在光鏡下對(duì)Atg7敲除的HBMEC和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，我們未發(fā)現(xiàn)形態(tài)上有明顯改變。

綜上所述，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了Atg7基因穩(wěn)定敲除的HBMEC，這將極大促進(jìn)我們對(duì)Atg7基因在腦血管的發(fā)育和血腦屏障形態(tài)建成的機(jī)制以及腦血管相關(guān)疾病的研究。