曹躍鵬，袁旦平，龐洪雙，趙振亞，李璐，陶勇

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居所有惡性腫瘤發(fā)病率的第3 位，死亡率位居第2 位[1]。關(guān)于結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為的分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚,但普遍認(rèn)為其涉及多基因、多步驟的調(diào)控過(guò)程。隨著研究的深入，已有研究表明細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的破壞損傷及細(xì)胞間黏附力的減低或喪失與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。因此，緊密連接蛋白基因家族成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，Claudin 蛋白是緊密連接的主要組成成分，尤其是Claudin-1 及Claudin-7 在細(xì)胞的異常增生、腫瘤的發(fā)生及發(fā)展等方面起著重要的作用[3-4]。目前，其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用研究有限，無(wú)明確論斷。本研究采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）檢測(cè)結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織中Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達(dá)，結(jié)合患者的臨床及隨訪資料，旨在分析結(jié)直腸癌組織Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達(dá)以及與患者預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年1 月至2016 年1 月寧波市第一醫(yī)院肛腸外科收治的行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的88例結(jié)直腸癌患者的術(shù)后標(biāo)本及其基本臨床資料。其中男51例，女37例；年齡41～79 歲，平均年齡（60.3±18.1）歲；結(jié)腸癌49例，直腸癌39例。所有患者均排除心、肝、腎等重要器官疾病，無(wú)合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病，無(wú)其他部位原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移瘤。所有病例術(shù)前均未經(jīng)任何抗腫瘤治療，術(shù)后對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪終止時(shí)間為2021 年1 月。研究的主要終點(diǎn)事件為總生存時(shí)間（OS），其定義為手術(shù)之日至出現(xiàn)任何原因引起的死亡時(shí)間或隨訪終止，非腫瘤相關(guān)性死亡歸為失訪。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 兔抗人Claudin-1 多克隆抗體（上海煊翎生物科技有限公司）；兔抗人Claudin-7 多克隆抗體（上海煊翎生物科技有限公司）；免疫組化試劑盒（上海煊翎生物科技有限公司）；DAB（氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒（濃縮型）：北京西雅金橋生物技術(shù)公司。所需標(biāo)本均用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，取出浸泡于95%乙醇中的清潔載玻片，涂布多聚賴氨酸干燥后制作4m厚度組織切片，行免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化（LP法）88例配對(duì)的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液高溫修復(fù)抗原，PBS 漂洗3 次后以0.3%過(guò)氧化氫-甲醇孵育10 min，清除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶活性，PBS漂洗4 次后滴加5%BSA 封閉液，室溫孵育60 min 傾去，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，冰箱4 ℃過(guò)夜。PBS 漂洗3 次后，再滴加二抗，室溫孵育20 min；PBS 漂洗3 次，再滴加試劑SABC 室溫孵育20 min；PBS 漂洗4 次，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，PBS 代替-抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：在10 個(gè)高倍顯微鏡下觀察，以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃棕色著色顆?；驁F(tuán)塊為 Claudin-1 及Claudin-7 陽(yáng)性細(xì)胞。低表達(dá)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%；高表達(dá)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 運(yùn)用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用2檢驗(yàn)。采用法計(jì)算生存率，以法檢測(cè)生存曲線的差異。采用單因素及多因素回歸分析法分析Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織及癌旁不同距離組織中Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達(dá)的比較 Claudin-1及Claudin-7 蛋白陽(yáng)性黃褐色顆粒主要分布在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中（封二彩圖1～4）。Claudin-1 蛋白在癌旁組織中呈高表達(dá)22.72%（20/88），在結(jié)直腸癌組織中高表率達(dá)80.68%（71/88）；Claudin-7 蛋白在癌旁組織中高表達(dá)90.91%（80/88），在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)率達(dá)45.45%（40/88）；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=59.18、29.33，均＜0.05）。

2.2 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM 分期均有關(guān)（均＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小及位置、血清CEA 等均無(wú)關(guān)（均＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的生存分析 隨訪10～60（中位數(shù)43）個(gè)月，其中失訪11例（包括非腫瘤相關(guān)死亡病例）。Claudin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與Claudin-7 蛋白陰性表達(dá)組5 年總生存率分別為27.91%（19例）與49.86%（8例），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=9.59＜0.05）。Claudin-7蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與Claudin-7 蛋白陰性表達(dá)組5 年總生存率分別為48.70%（23例）與27.90%（10例），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=8.70＜0.05），見(jiàn)封二彩圖5～6。

2.4 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的影響因素分析 Cox 回歸模型單因素及多因素顯示，TNM 分期晚、浸潤(rùn)程度深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Claudin-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)及Claudin-7 蛋白陰性表達(dá)均是結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的獨(dú)立高危因素（均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌患者總生存預(yù)后影響因素的預(yù)后分析

3 討論

結(jié)直腸癌是全球死亡率較高的惡性腫瘤。盡管對(duì)于結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)取得了較好的進(jìn)展；但要闡明其分子機(jī)制仍然有大量的工作需要完成，而分析結(jié)直腸癌組織與正常組織中的蛋白表達(dá)水平差異是研究其發(fā)病機(jī)制的重要途徑之一。Claudin 包含NH2-和COOH-端位于細(xì)胞內(nèi)部，C 末端可與內(nèi)層的蛋白分子連接；細(xì)胞外的肽鏈可以形成兩個(gè)跨膜的環(huán)，這兩個(gè)環(huán)可以和鄰近的其他細(xì)胞的同種類(lèi)型環(huán)相接觸而行使功能[5]?，F(xiàn)已證實(shí)，Claudin 蛋白是構(gòu)成緊密連接的骨架蛋白，參與維持細(xì)胞極性和滲透性，黏膜屏障及信號(hào)傳導(dǎo)功能，其功能改變與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[6]。

結(jié)直腸癌與Claudin 緊密連接蛋白是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其異常表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程。大量證據(jù)表明，由于組織特異性不同，Claudin 種類(lèi)在癌組織中表達(dá)量也不同[7]。本研究從臨床表型入手，以較大的樣本量（88例結(jié)直腸癌患者臨床組織），通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)方法分析Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表達(dá)情況。本文結(jié)果表明Claudin-1 在癌組織中高表達(dá)，而Claudin-7 處于低表達(dá)。本研究免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性黃褐色顆粒主要分布在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)比患者的臨床信息后發(fā)現(xiàn)，Claudin 蛋白更多地與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Claudin蛋白可能通過(guò)改變細(xì)胞間黏附力，促使腫瘤細(xì)胞極性的生長(zhǎng)失控。因此，本研究也嘗試用臨床資料來(lái)分析Claudin 蛋白與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系；結(jié)果顯示，Claudin-1 蛋白高表達(dá)及Claudin-7 蛋白低表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)程度相關(guān)，說(shuō)明該蛋白與結(jié)直腸癌惡性程度相關(guān)。目前認(rèn)為，在腸癌組織中Claudin-1過(guò)表達(dá)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)可使E-鈣黏連蛋白受抑制，從而使-catenin 蛋白/T 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，促使腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。亦有研究顯示，Claudin-1 過(guò)表達(dá)能明顯誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2），引起緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能破壞，導(dǎo)致組織黏附力下降或黏附分子破壞。繼而使腫瘤細(xì)胞易脫離原發(fā)灶，黏附于周?chē)g質(zhì)或正常細(xì)胞基膜、血管、淋巴管。腫瘤細(xì)胞遷涉力侵襲力增加促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9]。此外，在腫瘤組織中Claudin-7蛋白表達(dá)水平降低或不表達(dá)，與發(fā)生腫瘤時(shí)，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞間黏附性降低或丟失，失去限制腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和相關(guān)生長(zhǎng)因子供應(yīng)的作用，而使腫瘤細(xì)胞缺乏分化，侵襲力增強(qiáng)[10]。Claudin-7 蛋白的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[11]。因此，其可能是結(jié)直腸癌的一種潛在的抑制劑。

本研究結(jié)合Cox 回歸分析顯示，Claudin-1 高表達(dá)及Claudin-7 低表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另有研究顯示Claudin-1 水平的升高與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，是影響總體存活率的獨(dú)立預(yù)后因素，可作為潛在的預(yù)后因素[12]。Philip 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-7 表達(dá)和調(diào)控，與侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的相關(guān)性，參與結(jié)直腸癌進(jìn)展，影響預(yù)后[13]。本研究中，筆者還對(duì)Claudin-1 及Claudin-7的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌生存時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行了觀察分析，結(jié)果顯示Claudin-1 蛋白高表達(dá)組與Claudin-7 蛋白低表達(dá)組5 年總生存率分別為27.91%和49.86%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?＜0.05）。相反，Claudin-7 蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與Claudin-7 蛋白陰性表達(dá)組5 年總生存率分別為48.70%與27.90%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?＜0.05）。

綜上所述，Claudin-1 高表達(dá)及Claudin-7 低表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并影響患者預(yù)后，對(duì)判斷手術(shù)后結(jié)直腸癌患者預(yù)后具有較好的參考價(jià)值。