李國(guó)秀，崔利輝，劉穎沙

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西 楊凌 712100)

0 引言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們對(duì)高品質(zhì)食品尤其是有機(jī)食品的需求日益增加。目前全球有上百個(gè)國(guó)家開展有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，我國(guó)自21世紀(jì)以來(lái)也大力發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)，有機(jī)農(nóng)業(yè)面積達(dá)300萬(wàn)hm2，為全球第3大有機(jī)食品生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1]。與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)模式不同，有機(jī)農(nóng)業(yè)禁用農(nóng)藥、化肥等合成品，提倡使用有機(jī)肥并對(duì)產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量有嚴(yán)格要求。因此，大多有機(jī)農(nóng)場(chǎng)均直接或間接地使用禽畜糞便作為肥料，并導(dǎo)致其中污染物大量進(jìn)入土壤[2-4]。

抗生素是禽畜糞便中的主要污染物之一，施用禽畜糞肥或用養(yǎng)殖廢水灌溉可導(dǎo)致抗生素大量進(jìn)入農(nóng)田土壤，進(jìn)而被農(nóng)作物吸收積累，并威脅人類健康[5-7]。蔬菜是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚氖澄?，也是十分重要的?jīng)濟(jì)作物，其安全性是政府及老百姓十分關(guān)注的問題，也是農(nóng)產(chǎn)品提質(zhì)增效及可持續(xù)發(fā)展所面臨的重要問題。大量研究表明，蔬菜可從土壤中吸收并積累抗生素[8-10]。本研究對(duì)陜西省楊凌區(qū)及其周邊蔬菜基地土壤中的抗生素污染狀況進(jìn)行了全面的檢測(cè)分析，可為本地區(qū)蔬菜的安全生產(chǎn)、保障蔬菜的質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB4500型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB Sciex公司)；OSJ-UP-V型超純水機(jī)(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州市亞榮儀器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(上海啟前電子科技有限公司)；MD-200型氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；Mixplus型旋渦混合器(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司)；KQ-AS1000GVDE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-6090型真空干燥箱(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)；TG1650-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；AR2140型電子天平(美國(guó)奧豪斯)；SPE-12型固相萃取裝置(天津艾維歐科技發(fā)展有限公司)。

19種抗生素(表1)標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；甲醇和乙腈為色譜純；85%磷酸、36%冰醋酸、檸檬酸、正己烷、鹽酸、無(wú)水硫酸鈉、十二水合磷酸氫二鈉、乙酸銨和乙二胺四乙酸二鈉均為分析純，試驗(yàn)用水均為超純水。

表1 4類抗生素質(zhì)譜條件參數(shù)

1.2 樣品采集與預(yù)處理

楊凌位于陜西關(guān)中平原中部，屬陜西省咸陽(yáng)市轄區(qū)，是全國(guó)農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)。2018年10月—2019年9月，在楊凌示范區(qū)及周邊的扶風(fēng)縣絳帳鎮(zhèn)、武功縣武功鎮(zhèn)、周至啞柏鎮(zhèn)等共選取20個(gè)蔬菜生產(chǎn)基地進(jìn)行采樣，按照HJ/T 166—2004《土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行土壤樣品采集[11]。

每個(gè)采樣基地均采用5點(diǎn)采樣法，采取0～20 cm表層土壤樣品進(jìn)行混合，將待測(cè)土壤樣品平鋪在風(fēng)干盤上，去除土壤中的雜物，放于通風(fēng)陰涼處自然風(fēng)干，研磨后過60目篩，置于冰箱密閉避光保存，待測(cè)。

1.3 土壤樣品前處理

參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法，對(duì)不同種類抗生素分別進(jìn)行以下不同預(yù)處理[12-14]。

1.3.1 喹諾酮類抗生素前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g土壤樣品，置于10 mL離心管中，加入50%硝酸鎂-10%氨水(96/4，v/v)5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，以4 500 r/min離心10 min，收集上清液。殘?jiān)蒙鲜龇椒ǚ磸?fù)提取2次，合并上清液，再過HLB固相萃取小柱(先后過6 mL甲醇和6 mL水)萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL 1%乙酸-乙腈洗脫小柱。洗脫液在40 ℃下用氮?dú)獯抵两?，用乙?水(20/80，v/v)定容至1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，收集于樣品瓶中待測(cè)。

1.3.2 四環(huán)素類抗生素前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g土壤樣品置于10 mL離心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液/甲醇(1/1，v/v)5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，以4 500 r/min離心10 min，收集上清液。殘?jiān)瓷鲜龇椒ǚ磸?fù)提取2次，合并上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積不變，再過HLB固相萃取小柱(先后過6 mL甲醇和6 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液)萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL甲醇洗脫小柱。洗脫液在40 ℃下用氮?dú)獯抵两?，用甲?水(3/2，v/v)定容至1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，收集于樣品瓶中待測(cè)。

1.3.3 磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g左右土壤樣品置于10 mL離心管中，加入檸檬酸-MgCl2緩沖液/乙睛(1/1，v/v)5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，以4 500 r/min離心10 min，收集上清液。殘?jiān)瓷鲜龇椒ǚ磸?fù)提取2次，合并上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積不變，再過HLB固相萃取小柱(先后過6 mL甲醇和6 mL水)萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL甲醇洗脫小柱。洗脫液在40 ℃下用氮?dú)獯抵两?，用甲?水(3/2，v/v)定容至1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，收集于樣品瓶中待測(cè)。

1.4 抗生素檢測(cè)方法

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對(duì)土壤樣品中4大類19種抗生素(表1)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.1 色譜條件參數(shù)

色譜柱：Kinetex Bipheny C18(50 mm×30 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序(B%)：0～5 min 20%～90%，5～7 min 90%；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件參數(shù)

相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。質(zhì)譜分析離子流如圖1所示。

圖1 質(zhì)譜分析離子流Fig.1 Ion flow analyzed by mass spectrometry

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013及SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中喹諾酮類抗生素含量特征

土壤樣品中喹諾酮類抗生素含量特征如表2所示。在檢測(cè)的20個(gè)土壤樣本中，4種喹諾酮類抗生素總含量(ΣQNs)在14.64～103.37 μg/kg，平均含量為51.76 μg/kg?？偤糠植记闆r如圖2所示，<30 μg/kg的占20%，30～60 μg/kg的占45%，60～90 μg/kg的占25%，>90 μg/kg的占10%。諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢出率均為100%，洛美沙星的檢出率為85%，且其中小部分(15.4%)低于定量限。4種化合物的平均含量從高到低依次為諾氟沙星>環(huán)丙沙星>恩諾沙星>諾美沙星。土壤中喹諾酮類化合物組成以諾氟沙星為主，其次為環(huán)丙沙星和恩諾沙星，而洛美沙星的含量很低。大部分土壤樣品能同時(shí)檢出4種喹諾酮類化合物，但各化合物的含量主要在50 μg/kg以下。本研究區(qū)域蔬菜基地土壤中喹諾酮類抗生素含量低于鄒慧云等[7]的報(bào)道(平均含量161.07 μg/kg)，與邰義萍[12]、趙慧男[15]、段夏珍[16]的報(bào)道結(jié)果相近。

表2 土壤中喹諾酮類抗生素含量特征

圖2 土壤中喹諾酮類抗生素總含量區(qū)間分布Fig.2 Range distribution of total quinolone antibiotics content in soil

2.2 土壤中四環(huán)素類抗生素含量特征

由表3可知，四環(huán)素類抗生素總含量(ΣTCs)在2.41～36.96 μg/kg，平均值為12.77 μg/kg，全部低于50 μg/kg?？偤糠植记闆r如圖3所示，<10 μg/kg的占40%，10～30 μg/kg的占55%，30～50 μg/kg的占5%。4種四環(huán)素類化合物的檢出率均高于80%，平均含量分別為6.62、1.15、3.91和1.09 μg/kg。土壤中4環(huán)素類化合物組成以土霉素為主，其次為金霉素，而四環(huán)素和強(qiáng)力霉素的含量較低。大部分土壤樣品能同時(shí)檢出4種四環(huán)素類化合物，但各化合物的含量主要在10 μg/kg以下。本研究區(qū)域蔬菜基地土壤中四環(huán)素類化合物含量低于張?zhí)m河等[17]、邰義萍等[18]、李彥文等[19]、郎朗等[20]的報(bào)道，污染程度較低。

表3 土壤中四環(huán)素類抗生素含量特征

圖3 土壤中四環(huán)素類抗生素總含量區(qū)間分布Fig.3 Range distribution of total content of tetracycline antibiotics in soil

2.3 土壤中磺胺類抗生素含量特征

土壤樣本中磺胺類抗生素的含量特征如表4所示。8種磺胺類化合物的總含量(ΣSAs)在0.10～2.94 μg/kg，平均值為1.14 μg/kg。僅磺胺二甲嘧啶(SM2)全部檢出，最高含量為2.61 μg/kg，其余7種磺胺類化合物均<1 μg/kg。單個(gè)化合物平均含量順序?yàn)榛前范谆奏?SM2)>磺胺甲惡唑(SMZ)>磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SM)>磺胺嘧啶(SD)>磺胺吡啶(SPD)>磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)>磺胺甲基嘧啶(SMl)>磺胺噻唑(ST)。因此，土壤中磺胺類抗生素以磺胺二甲嘧啶(平均值0.69 μg/kg)為主。成玉婷等[21]研究得出，廣州市典型有機(jī)蔬菜基地土壤中磺胺類抗生素總含量在0.73～973 μg/kg，平均含量為116 μg/kg。張?zhí)m河等[17]研究得出，菜田溫室土壤中磺胺類抗生素含量為4.13～34.70 μg/kg，平均含量為13.41 μg/kg，均高于本研究區(qū)域蔬菜基地土壤樣本中磺胺類抗生素的含量，說(shuō)明本研究區(qū)域污染水平較低。

表4 土壤中磺胺類抗生素含量特征

表5 土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量特征

2.4 土壤中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量特征

土壤樣本中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量特征如表5所示?？偤吭?(低于檢測(cè)限)～10.13 μg/kg，平均含量為1.23 μg/kg。螺旋霉素、紅霉素和羅紅霉素檢出率均很低，分別為20%、40%和15%。3個(gè)化合物平均含量從高到低依次為紅霉素>螺旋霉素>羅紅霉素，以紅霉素為主。

3 結(jié)論

對(duì)楊凌區(qū)及其周邊20個(gè)蔬菜生產(chǎn)基地的土壤樣品中喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類4大類19種抗生素的含量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明，研究區(qū)域蔬菜基地土壤中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類3類抗生素均100%檢出，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出率為62%。

4類抗生素平均含量由高到低依次為喹諾酮類(51.76 μg/kg)>四環(huán)素類(12.77 μg/kg)>磺胺類(1.14 μg/kg)>大環(huán)內(nèi)酯類(1.23 μg/kg)，分別以諾氟沙星、土霉素、磺胺二甲基嘧啶和紅霉素為主。

目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)土壤中抗生素的限量要求，根據(jù)獸藥國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)(VICH)籌劃指導(dǎo)委員會(huì)提出的土壤中抗生素生態(tài)毒害效應(yīng)的觸發(fā)值(100 μg/kg)，研究區(qū)域土壤中4大類抗生素的含量均小于該觸發(fā)值，生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)較小[21-22]。與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的研究報(bào)道相比，本研究區(qū)域的蔬菜基地抗生素污染程度也處于相對(duì)較低的污染水平。

研究區(qū)域蔬菜基地土壤中4大類典型抗生素均有檢出，說(shuō)明土壤受到抗生素一定程度的污染。由于土壤中抗生素的積累會(huì)影響到土壤中正常微生物菌群的生長(zhǎng)繁殖，而且會(huì)進(jìn)一步遷移到種植的作物中，因此會(huì)危害生態(tài)環(huán)境安全和食品安全[5，23]。土壤中的抗生素主要來(lái)源于污水灌溉和畜禽糞便的直接施用，蔬菜生產(chǎn)從業(yè)人員應(yīng)建立農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全意識(shí)，不用污水灌溉，合理施用有機(jī)肥，避免土壤中抗生素的積累。