■于 航 王海默 鐘世勛 呂月琴 劉兆勝 孫汝江*

（1.中國農業(yè)大學煙臺研究院，山東煙臺 264670；2.山東深海生物科技股份有限公司，山東煙臺 265500）

近年來，畜禽產品中抗生素的殘留問題受到越來越多的重視，此外，由于抗生素使用不當，機體抵抗力也會下降，容易對細菌產生一定的耐藥性。目前，飼料端抗生素類添加劑的使用已經全面禁止。如何通過在飼料中添加其他抗菌物質來提高畜禽的抗病能力，便成為研究的熱點問題?？咕氖且环N由生物體自身編碼的多肽類物質，具有廣譜抗菌活性，因其抗菌機理獨特、無耐藥性隱患且無殘留，已成為抗生素的良好替代品，在實際的畜牧生產中具有廣泛的應用前景[1]。關于抗菌肽的研究已有許多，例如，抗菌肽在提高動物免疫能力和疾病防御能力等方面具有促進作用[2-3]；抗菌肽可通過刺激黏液合成、促進緊密連接蛋白的產生和腸屏障的修復，影響腸上皮屏障完整性的維持[4]。一些報道表明，抗菌肽有與抗生素所不同的作用機制，相比于抗生素通過抑制細菌細胞壁的產生、蛋白質和DNA的合成等來達到抑菌的作用[5]，抗菌肽主要通過與細菌細胞膜作用來達到抑菌的目的，不易產生耐藥性[6]；此外，抗菌肽還可通過調節(jié)適應性免疫反應或作為趨化因子招募其他效應細胞來發(fā)揮作用[7]。本試驗測定了抗菌肽APSH-07對常見致病菌的抑菌活性，以及與常用抗生素體外聯(lián)合使用的協(xié)同殺菌效應，并探究抗菌肽APSH-07成為新型飼料添加劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

大腸桿菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC6538P、哈維氏弧菌ATCCC BAA-1117、副溶血弧菌ATCC17802，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。試驗菌株均保存于含20%甘油的冷凍管中，置于-80℃冰箱中。

1.1.2 主要試劑

阿莫西林（amoxicillin，純度>98%），土霉素（oxy?tetracycline，純度>98%），硫酸慶大霉素（gentamicin sulphate，純度≥590 U/mg），硫酸新霉素（neomycin sul?fate，純度99%），鹽酸強力霉素（doxycycline hyclate，純度>98%），均購自上海泰坦科技股份有限公司，保存于4℃冰箱中陰暗處；抗菌肽APSH-07，由山東深海生物科技股份有限公司提供，避光保存。

LB培養(yǎng)基粉末購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。LB培養(yǎng)基配方見表1。

表1 LB培養(yǎng)基配方

依據(jù)試驗需要，配置兩種培養(yǎng)基：

LB肉湯培養(yǎng)基：準確稱量25 g LB粉末溶解于1 L蒸餾水，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃高壓滅菌20 min后，保存于4℃冰箱待用；

LB瓊脂培養(yǎng)基：準確稱量25 g LB粉末和15 g瓊脂粉末溶解于1 L蒸餾水中，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃高壓滅菌20 min后，保存于4℃冰箱待用。

1.2 制備菌懸液

將冷凍保存的菌株常溫下解凍，在LB瓊脂平板上接種劃線，于37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。菌落形成后，挑選平板上的單個菌落接種至50 mL新鮮LB肉湯培養(yǎng)基中，隨后將肉湯置于37℃恒溫搖床中，以170 r/min的速度震蕩12～18 h直至菌液渾濁。經過稀釋，在分光光度計下測得OD600=0.5左右，即可作為試驗菌液。

1.3 藥敏試驗

1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定

將藥品取出，配成一系列濃度梯度的溶液。用滅菌的LB肉湯將抗菌肽APSH-07配置成1 280μg/mL的儲液，將抗生素配成320μg/mL的儲液。之后繼續(xù)用滅菌的LB肉湯將抗菌肽APSH-07的儲液進行一系列雙倍稀釋，共得到1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL等10個濃度梯度的APSH-07稀釋液；用滅菌LB肉湯將抗生素儲液進行一系列雙倍稀釋，共得到320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL等10個濃度梯度的抗生素稀釋液。

向無菌96孔板的1～10孔依次加入90μL菌懸液，并相應混合以10μL不同濃度的抗菌肽APSH-07或抗生素稀釋液。在第11孔加入100μL的菌懸液作為陽性對照，在第12孔加入100μL的LB肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照。注意每次混合液體時要用移液槍吹打均勻。

液體添加完畢后，將96孔板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察底部是否有細菌沉淀產生。無肉眼可見細菌沉淀的最小濃度即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。每種藥物做3次重復。

1.3.2 最小殺菌濃度（MBC）的測定

取各藥物MIC、2×MIC、4×MIC濃度的內容物各10μL，滴加至LB固態(tài)培養(yǎng)基上進行涂板，每個小孔做3次重復。待液體內容物被完全吸收后，將平板轉移到37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置，培養(yǎng)18～24 h，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長。無菌落生長的培養(yǎng)基對應的最小濃度即為該種藥物的最小殺菌濃度（MBC）。

1.3.3 抗菌肽APSH-07與抗生素的聯(lián)合藥敏試驗

以抗菌肽APSH-07和土霉素聯(lián)用為例：分別配置2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍MIC濃度的抗菌肽APSH-07與土霉素溶液。進行6×6棋盤試驗，土霉素以橫行方式，APSH-07以縱列方式，將5μL各自不同濃度的藥液加入96孔板中,每孔再加菌液90μL。由此，使得每一橫行孔中土霉素的濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍的MIC，同時每一橫行孔中APSH-07濃度不變；每一縱列孔中APSH-07的濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍的MIC，同時每一縱列孔中土霉素的濃度不變?；旌暇鶆蚝螅瑢?6孔板轉移到37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。做3次重復。

在實驗室中，以部分抑菌濃度指數(shù)(fractional in?hibitory concentration index,FIC Index)作為聯(lián)合藥敏試驗效果的判斷依據(jù)：

FIC Index=MIC A’/MIC A+MICB’/MICB

式中：MICA和MICB——A、B藥物單獨用藥時的MIC值；

MICA’和MICB’——A、B兩藥聯(lián)用時各自的MIC值。

根據(jù)FIC Index的范圍可以判斷聯(lián)合藥敏試驗的效果：FIC Index≤0.5為協(xié)同效應；0.52為頡頏作用。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽APSH-07和抗生素單獨使用的MIC與MBC值（見表2）

表2 抗菌肽APSH-07與抗生素對常見致病菌的MIC與MBC測定值

從表2中可看出，APSH-07對于四種菌的MIC與MBC均在4μg/mL以內，有較強的抑制作用。其中，APSH-07對于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，對于其他三種革蘭氏陰性菌抑制效果稍弱。五種抗生素對于除了副溶血弧菌的三種菌均有良好的抑制效果，其中鹽酸強力霉素對大腸桿菌和哈維氏弧菌的抑制作用最明顯；但對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制效果稍弱一些。此外，在副溶血弧菌的試驗中，五種抗生素均未檢測到對其的抑制性。而操慶國等[8]通過試驗證明了土霉素、新霉素等八種抗生素對副溶血弧菌的生長均產生抑制作用，這說明本試驗的副溶血弧菌菌株可能對抗生素產生了耐藥性，但產生耐藥性的原因尚未可知。

2.2 抗菌肽APSH-07和抗生素聯(lián)合藥敏試驗的結果（見表3～表7）

抗菌肽APSH-07分別與阿莫西林、土霉素、硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、鹽酸強力霉素聯(lián)用，對金黃色葡萄球菌ATCC6538P、大腸桿菌CICC21482、哈維氏弧菌ATCCC BAA-1117的體外協(xié)同抗菌試驗結果如表3～表7。

表3 抗菌肽APSH-07與阿莫西林單用和聯(lián)用的作用效果

表4 抗菌肽APSH-07與土霉素單用和聯(lián)用的作用效果

表5 抗菌肽APSH-07與硫酸新霉素單用和聯(lián)用的作用效果

表7 抗菌肽APSH-07與鹽酸強力霉素單用和聯(lián)用的作用效果

表6 抗菌肽APSH-07與硫酸慶大霉素單用和聯(lián)用的作用效果

根據(jù)試驗結果可知，抗菌肽APSH-07與阿莫西林聯(lián)用，對于哈維氏弧菌的抗菌效果最明顯；與硫酸新霉素聯(lián)用，對金黃色葡萄球菌ATCC6538P的抗菌效果最不好，但APSH-07與以上五種抗生素聯(lián)用的FIC值均小于1，大部分小于0.5，均未有頡頏作用發(fā)生。此外，協(xié)同作用時，抗菌肽APSH-07的MIC值僅為其單獨作用時的1/8～1/2，具有較為優(yōu)良的作用?？偟膩砜矗珹PSH-07與阿莫西林聯(lián)用時聯(lián)合抗菌效果最好，表現(xiàn)為協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)均小于或等于0.5，二者的相互促進作用更明顯。

3 討論

抗菌肽APSH-07是通過高效定向誘導植物乳桿菌表達的一種具有抗菌活性的小肽類物質，由于其三維結構中存在穩(wěn)定的二硫鍵，故而性質穩(wěn)定，對高溫以及酸、堿、蛋白酶等具有良好的耐受性，可在動物體內正常發(fā)揮功能而不輕易失活。這種抗菌肽作為乳酸桿菌代謝過程產物，可以抑制脂多糖刺激產生的炎性因子mRNA的表達，同其發(fā)酵產物乳酸一起抑制LPS誘導的相關蛋白的活性，進而起到抑菌防腐、減輕腸道炎癥、促進營養(yǎng)物質消化吸收等作用，但對腸道益生菌幾乎無影響。Ge等[4]在日糧中添加APSH-07，顯著提高了大黃魚肝臟的SOD、CAT活性；Chen等[9]也發(fā)現(xiàn)，適量的APSH-07可增強皺紋盤鮑的抗氧化作用，并顯著降低副溶血弧菌導致的死亡。

本試驗將抗菌肽APSH-07與五種常用抗生素的抑菌活性進行對比，并將APSH-07與抗生素聯(lián)用來測定協(xié)同抑菌效應，結果表明，APSH-07和抗生素對常見的致病菌均有抑菌效果，并且聯(lián)合使用后效果比單獨使用要好。這說明當抗菌肽和抗生素聯(lián)合抑菌時，他們可能結合了各自的作用機理，從而使細菌更有效地被抑制或殺滅，同時，也闡明了抗菌肽代替抗生素的可行性。

在抗菌肽與抗生素聯(lián)合使用方面，已有諸多研究。Wakabayashi等[10]的研究表明，抗菌肽LFcinB與二甲胺四環(huán)素聯(lián)用可增強對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。華蕊等[11]通過試驗發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽PR-39與阿莫西林、土霉素、硫酸鏈霉素等聯(lián)用，具有不同程度的協(xié)同作用。王國棟[12]也發(fā)現(xiàn)抗菌肽PG-1與丁胺卡那霉素、四環(huán)素聯(lián)用對大腸桿菌的抑制有協(xié)同或相加作用。在畜禽疾病的治療過程中，可將抗菌肽和抗生素混合使用，在更好地提高用藥效果的同時，還可以預防并延遲抗生素耐藥性的發(fā)生。因此，抗生素與抗菌肽的聯(lián)用，可以作為畜牧生產中的一個發(fā)展方向。關于APSH-07具體的作用機制以及對動物可能產生的負面影響等問題，可在今后的試驗中繼續(xù)研究并予以完善。

4 結論

本試驗證明，抗菌肽APSH-07對常見致病菌有一定的抑制作用，并和阿莫西林、土霉素、硫酸慶大霉素、硫酸新霉素、鹽酸強力霉素聯(lián)用有協(xié)同或部分協(xié)同作用，為實際應用提供了方向，這體現(xiàn)了APSH-07替代抗生素類添加劑成為新型的飼料添加劑的潛力。