■安 琦 曹亞彬 牛彥波 吳皓瓊 原 韜

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010）

仔豬胃腸道發(fā)育不完善，免疫力低，易發(fā)生腸道疾病，隨著我國(guó)全面禁止使用抗生素，部分小型養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬因胃腸疾病病死率可達(dá)到20%～30%，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1-2]。應(yīng)用科學(xué)手段預(yù)防仔豬腹瀉成為行業(yè)內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)。中草藥在我國(guó)有廣泛悠久的應(yīng)用歷史，飼料中添加適量的中草藥，能夠起到提高適口性、增強(qiáng)免疫力、提高增重等功效[3-4]。此外，中草藥的毒副作用低，未發(fā)現(xiàn)耐藥性和產(chǎn)品殘留方面的問(wèn)題[5]。目前，中藥材利用率僅為30%～70%，中藥渣中除了含有粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分外，還殘留有一定量的多糖、黃酮和皂苷等生物活性成分，可作為飼料添加劑[6-8]。研究表明，在養(yǎng)殖飼料中添加經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理的中藥渣，不但可以增強(qiáng)畜禽的體質(zhì)狀況，還能夠起到其他添加劑所達(dá)不到的藥用功能，降低精飼料的用量，降低生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)收入[9-12]。研究表明，日糧添加中草藥添加劑可顯著提高日增重、提高肌肉大理石紋評(píng)分、顯著降低失水率、增加肌肉粗脂肪含量[13]。研究表明，用發(fā)酵五味子藥渣添加劑飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)仔豬的腹瀉率和料重比降低，豬腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，仔豬的免疫功能有所提高[14-15]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中藥制藥企業(yè)每年產(chǎn)生數(shù)以千萬(wàn)噸的中藥藥渣，多數(shù)生產(chǎn)廠家將藥渣作為廢料垃圾處理，造成了資源的巨大浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題。如何有效利用藥渣資源，避免藥渣因長(zhǎng)期堆放引起的環(huán)境污染是一個(gè)全新的課題。本研究采用的藥渣來(lái)源于中藥雙黃連中主要原料——黃芩藥渣，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，主治上呼吸道感染、肺熱咳嗽、肺炎、痢疾等癥狀[16-17]。本研究利用植物乳桿菌對(duì)黃芩藥渣進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后的藥渣用于仔豬飼喂試驗(yàn)，觀察其對(duì)仔豬增重、腹瀉率、腸道微生物群落及免疫功能的影響。通過(guò)對(duì)黃芩藥渣進(jìn)行二次利用，旨在減少環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，為開(kāi)發(fā)新型中藥渣飼料添加劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物乳桿菌菌種為植物乳桿菌植物亞種(Lacto?bacillus plantarum)，分離自黃芩藥渣。保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC No.20963)。黃芩廢渣取自雙黃連生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的中藥廢渣，藥渣經(jīng)粉碎，過(guò)20目篩網(wǎng)，備用。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.28 g/L、吐溫80 1.0 g/L、pH 6.2～6.4。

1.2 黃芩藥渣發(fā)酵

取斜面菌種，于平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，30℃倒置培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單菌落；單菌落接種于液體活化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間24 h；將活化好的菌種接種于發(fā)酵罐中，控制溫度37～43℃，時(shí)間24～36 h，制備發(fā)酵液。菌液中植物乳桿菌的含量≥108CFU/mL。

粉碎后的藥渣加入物料總重量80%～100%的水，攪拌均勻；高壓滅菌，物料厚度≤30 cm，120℃滅菌30 min；藥渣粉降溫至35～37℃；向冷卻后的物料中加入植物乳桿菌菌液，接種量為5%，于密閉發(fā)酵罐中厭氧發(fā)酵72 h；發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得pH為4.5，植物乳桿菌菌數(shù)≥108CFU/g，得到發(fā)酵藥渣，平行處理無(wú)乳酸菌發(fā)酵黃芩藥渣作為未發(fā)酵藥渣備用。

1.3 仔豬喂養(yǎng)試驗(yàn)

選取大三元雜交健康無(wú)病的21日齡仔豬72頭，隨機(jī)分為3組，每組24頭，采食同種飼糧，試驗(yàn)期為28 d，免疫和管理按豬場(chǎng)常規(guī)進(jìn)行。試驗(yàn)分為黃芩藥渣組、發(fā)酵藥渣組、對(duì)照組。對(duì)照組仔豬僅飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組仔豬在基礎(chǔ)日糧中分別添加黃芩藥渣和發(fā)酵黃芩藥渣，添加量為2 kg/t，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 斷奶仔豬日增重情況測(cè)定

試驗(yàn)仔豬分別于0、14 d和28 d空腹12 h后進(jìn)行稱重、記錄，以計(jì)算不同時(shí)期及全期仔豬的增重情況。對(duì)0～28 d仔豬腹瀉情況進(jìn)行評(píng)定：觀察并記錄試驗(yàn)期每頭仔豬每天的腹瀉情況。

腹瀉率（%）=試驗(yàn)期腹瀉仔豬頭次/（試驗(yàn)豬頭次×試驗(yàn)天數(shù)）×100

1.5 斷奶仔豬盲腸微生物菌群的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取仔豬5頭，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎盲腸兩端，切下盲腸。在無(wú)菌操作臺(tái)中，準(zhǔn)確稱取盲腸內(nèi)容物1 g放于盛有99 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩，取稀釋液進(jìn)行10倍稀釋，吸取0.1 mL稀釋液接種于選擇性培養(yǎng)基上。其中，大腸桿菌用伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；乳酸菌用MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.6 斷奶仔豬血清抗氧化指數(shù)的測(cè)定

試驗(yàn)28 d，各試驗(yàn)組隨機(jī)選取健康狀況良好、體重相近的仔豬5頭，空腹前腔靜脈采血30 mL，靜置，3 000 r/min離心10 min，離心后血清分裝于離心管中，-30℃保存待測(cè)?？寡趸笜?biāo)的測(cè)定：采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、采用比色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）活性、采用硫代巴比妥酸法（TBA）測(cè)定丙二醛（MDA）含量，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.7 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)28 d，各試驗(yàn)組隨機(jī)選取健康狀況良好、體重相近的仔豬5頭，空腹前腔靜脈采血30 mL，靜置，3 000 r/min離心10 min，離心后血清分裝于離心管中，-30℃保存待測(cè)。血清免疫指標(biāo)IgA、IgG、IL-4采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定。

1.8 藥理學(xué)毒性試驗(yàn)

選取體重為18～22 g的ICR鼠60只，經(jīng)3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)均分為3組（雌雄各半），黃芩藥渣、發(fā)酵藥渣和空白對(duì)照組，每組各20只；空白對(duì)照組灌胃生理鹽水，黃芩藥渣、發(fā)酵藥渣組將制備的制劑溶于水中灌服，黃芩藥渣、發(fā)酵藥渣的藥物添加量為0.1 g/mL，0.4 mL/次，每日3次，連續(xù)7 d。每日觀察試驗(yàn)鼠的精神狀態(tài)、飲食情況，每日記錄發(fā)病死亡情況；對(duì)于死亡鼠進(jìn)行剖檢觀察內(nèi)臟變化；對(duì)試驗(yàn)鼠進(jìn)行定期稱重；試驗(yàn)結(jié)束，采集血液分離血清，測(cè)定AST、ALT。稱量ICR鼠體重，對(duì)其臟器指數(shù)進(jìn)行測(cè)定，取ICR鼠心臟、脾臟、肝臟、腎臟、睪丸、卵巢，稱重，按照下式計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)（%）=臟器重/體重×100

1.9 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

根據(jù)制備的發(fā)酵藥渣制劑，20、100 g/kg給1月齡ICR鼠連續(xù)灌胃給藥30 d，觀察動(dòng)物的皮毛、膚色、攝食、活動(dòng)、尿、便等有無(wú)異常。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

所有采集數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行前期處理，然后用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD進(jìn)行多重比較，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥發(fā)酵飼喂對(duì)比試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬日增重及腹瀉率的影響（見(jiàn)表2）

表2 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬日增重和腹瀉率的影響

由表2可知，0～14 d平均日增重，黃芩藥渣組較對(duì)照組提高5.98%，無(wú)顯著性差異（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣比對(duì)照組顯著提高7.19%（P<0.05），較黃芩藥渣組提高1.14%，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。15～28 d平均日增重，黃芩藥渣組較對(duì)照組提高6.44%（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組較對(duì)照組顯著提高45.62%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高36.80%（P<0.05）。0～28 d平均日增重，黃芩藥渣組比對(duì)照組提高6.15%（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組較對(duì)照組顯著提高29.38%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高21.88%（P<0.05）。0～28 d仔豬腹瀉率，各試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），其中發(fā)酵藥渣組仔豬腹瀉率最低。

2.1.2 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響（見(jiàn)表3）

由表3可知，發(fā)酵黃芩藥渣組的大腸桿菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；黃芩藥渣組大腸桿菌數(shù)量低于對(duì)照組但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。發(fā)酵黃芩藥渣組的乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），其中乳酸菌數(shù)量顯著高于黃芩藥渣組（P<0.05）。黃芩藥渣組乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量高于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）。

表3 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響

2.1.3 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬抗氧化性能的影響（見(jiàn)表4）

表4 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬抗氧化性能的影響

由表4可知，斷奶仔豬血清中T-SOD含量黃芩藥渣組較對(duì)照組提高14.66%，無(wú)顯著性差異（P>0.05）；發(fā)酵藥渣組較對(duì)照組顯著提高了40.52%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高了22.56%（P<0.05）。

斷奶仔豬血清中GSH含量試驗(yàn)組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。斷奶仔豬血清中MDA含量黃芩藥渣組較對(duì)照組降低51.61%，無(wú)顯著性差異（P>0.05）；發(fā)酵藥渣組較對(duì)照組分別顯著降低62.97%（P<0.05），較黃芩藥渣組降低23.48%（P>0.05）。

2.1.4 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬免疫指標(biāo)的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，仔豬血清中IgA含量發(fā)酵藥渣組高于對(duì)照組和黃芩藥渣組但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。黃芩藥渣組IgG含量較對(duì)照組提高2.41%，差異不顯著（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組IgG含量較對(duì)照組顯著提高42.08%(P<0.05)，較黃芩藥渣組顯著提高38.74%（P<0.05）。IL-4含量黃芩藥渣組較對(duì)照組提高3.99%，差異不顯著（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組較對(duì)照組顯著提高38.28%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高32.97%（P<0.05）。

表5 發(fā)酵藥渣添加劑對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

2.2 藥理學(xué)毒性試驗(yàn)

2.2.1 臨床癥狀與病理學(xué)觀察

結(jié)果顯示，對(duì)照組和試驗(yàn)組的ICR鼠精神狀態(tài)、飲食欲、對(duì)外界反應(yīng)能力未見(jiàn)明顯的異常，各組鼠均無(wú)發(fā)病和死亡。對(duì)對(duì)照組和試驗(yàn)組的ICR鼠進(jìn)行剖檢，眼觀未見(jiàn)內(nèi)臟器官有明顯的病理變化。

2.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)觀察

試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)ICR鼠稱量體重、臟器重，計(jì)算各臟器指數(shù)，分析見(jiàn)表6。

由表6可知，試驗(yàn)組ICR鼠肝臟、心臟、腎臟、肺臟、脾臟指數(shù)與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05），均處于正常范圍。

表6 各臟器指數(shù)分析(%)

2.2.3 肝臟功能變化觀察（見(jiàn)表7）

表7 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束后，采取血液分離血清，測(cè)定AST、ALT活性，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，試驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比差異不顯著，都處于正常范圍內(nèi)，飼喂發(fā)酵藥渣和發(fā)酵中藥對(duì)ICR鼠的肝臟功能無(wú)顯著毒副作用。

2.3 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，連續(xù)給ICR鼠灌胃30 d，動(dòng)物的皮毛、膚色、攝食、活動(dòng)、尿、便等均無(wú)異常；動(dòng)物的血常規(guī)，肝、腎功能等血液生化指標(biāo)和動(dòng)物的主要臟器指數(shù)均在正常范圍，且正常動(dòng)力無(wú)差異；病理組織學(xué)檢查表明，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、氣管、睪丸、卵巢等重要臟器無(wú)病理改變。停藥14 d后檢查以上各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯毒性反應(yīng)，表明無(wú)蓄積毒性。

3 討論

研究表明，腸道微生物菌群在提供保護(hù)性腸道屏障，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和代謝，同時(shí)在提高免疫力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18-20]。腸道微生物通過(guò)刺激腸道黏膜的正常發(fā)育，實(shí)現(xiàn)對(duì)斷奶仔豬腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用[8，21]。益生菌可通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)腸道黏膜表面結(jié)合位點(diǎn)，定植于腸道內(nèi)，從而調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物菌群的平衡，預(yù)防仔豬腹瀉發(fā)生[22-24]。本研究利用益生菌發(fā)酵雙黃連藥渣作為飼料添加劑，發(fā)酵產(chǎn)物兼具中草藥和益生菌的雙重功效，具有酸香味道，更有利于仔豬采食；還能夠提高仔豬腸道消化酶活性，促進(jìn)小腸消化和吸收，降低蛋白質(zhì)在大腸中的發(fā)酵，防止有害微生物的滋生，從而防止仔豬腹瀉。飼喂結(jié)果顯示，發(fā)酵黃芩藥渣組仔豬腸道中乳酸菌數(shù)量和雙歧桿菌數(shù)量分別可達(dá)4.16×108CFU/g和5.32×108CFU/g，顯著高于對(duì)照組，其大腸桿菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。植物乳桿菌發(fā)酵黃芩廢渣之后，能夠?qū)⒌谝淮谓徇^(guò)程中未得到提取的成分和活性物質(zhì)最大限度地轉(zhuǎn)化釋放，通過(guò)生物代謝使活性組分轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)，進(jìn)而提高其抗病能力。

此外，研究發(fā)現(xiàn)黃芩藥渣還能夠降低應(yīng)激反應(yīng)、提高機(jī)體抗病力及免疫應(yīng)答能力。仔豬血清免疫結(jié)果顯示，血清中的IgG、IL-4水平較藥渣組和對(duì)照組均有顯著提高；與對(duì)照組相比較，發(fā)酵黃芩藥渣組IgG含量顯著提高42.08%（P<0.05），IL-4含量顯著提高38.28%（P<0.05）。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)顯示，長(zhǎng)期飼喂發(fā)酵藥渣對(duì)小鼠各臟器無(wú)明顯毒副作用，表明發(fā)酵藥渣可作為飼料添加劑用于動(dòng)物喂養(yǎng)。綜上所述，黃芩藥渣發(fā)酵后，能夠改善動(dòng)物腸道健康，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)免疫力，能夠在一定程度上填補(bǔ)飼料行業(yè)全面禁抗后預(yù)防仔豬腹瀉方面的空白。在今后的研究中，發(fā)酵中藥渣與動(dòng)物腸道健康的互作機(jī)制值得進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié)論

經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的黃芩藥渣作為飼料添加劑，能夠有效降低仔豬的腹瀉率，提高仔豬增重，有助于提高仔豬免疫力，調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物菌群，為新型中藥渣飼料添加劑的開(kāi)發(fā)提供新的思路。