■產(chǎn)啟霞 王福強(qiáng)* 李 坤 憨素連

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116622）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我國重要的海水養(yǎng)殖種類，其肉味鮮美，營養(yǎng)價值高，具有重要的養(yǎng)殖意義[1]。益生菌是一種對動物和環(huán)境友好的飼料添加劑[2-3]。對水產(chǎn)動物生長和消化均有顯著促進(jìn)作用[4-7]，如斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[8]、大西洋鮭（Salmo salar）[9]等。當(dāng)前在水產(chǎn)上應(yīng)用的益生菌主要包括酵母菌（Saccharomycesspp.）、乳酸菌（Lactobacil?lusspp.）、芽孢桿菌（Bacillusspp.）等[10]。Irene等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合益生菌（芽孢桿菌和乳酸菌）比分別添加單一菌對烏頰魚（Cyprinus carpio）的生長和消化具有更好的促進(jìn)作用。復(fù)合益生菌是否能夠促進(jìn)大菱鲆幼魚生長和消化性能的報道較少。本試驗(yàn)研究了復(fù)合益生菌粉對大菱鲆的生長、消化和腸道益生菌數(shù)量的影響，以期探究復(fù)合益生菌粉對大菱鲆的調(diào)控作用，為可持續(xù)養(yǎng)殖提供有價值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大菱鲆幼魚購自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，在大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行試驗(yàn)。復(fù)合益生菌粉購于大連陽光白奧科技有限公司，由釀酒酵母[Saccharomyces cerevisiae，（8.4±2.3）×106CFU/g]、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，（6.7±1.8）×107CFU/g]和嗜酸乳桿菌[Lactobacilli acidophi?lus，（2.1±0.6）×108CFU/g]組成。各菌株濃度采用平板計(jì)數(shù)法[12]計(jì)算。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體重為（8.94±0.02）g大菱鲆幼魚375尾，隨機(jī)分為T0、T1、T2、T3、T45組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)25尾魚。T0組為對照組，T1、T2、T3、T4組為試驗(yàn)組，分別飼喂含0（0 g/kg）、0.2%（2 g/kg）、0.4%（4 g/kg）、0.6%（6 g/kg）、0.8%（8 g/kg）復(fù)合益生菌粉的飼料60 d。所有飼料原料經(jīng)粉碎后過80目篩，按飼料配方稱重，混合均勻后加入適量的水。用JZL型擠壓造粒機(jī)（購自常州品正干燥設(shè)備有限公司）制作直徑為2.0 mm的飼料，在室內(nèi)陰干，控制水分在10%左右后置于-20°C的冰箱中備用?；A(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平（%）

1.3 飼養(yǎng)管理

每天投喂2次（8:00和17:00各投喂1次），飼料投喂量為大菱鲆幼魚體質(zhì)量的3%，視攝食情況可做適當(dāng)調(diào)整。投喂后0.5 h吸除糞便和殘餌。試驗(yàn)在循環(huán)控溫養(yǎng)殖水槽（100 cm×60 cm×30 cm）中進(jìn)行，水溫控制在（18±1）℃。記錄日投喂量并將殘餌收集后烘干，用于總攝食量計(jì)算。第31 d開始收集其糞便，進(jìn)行消化率的測定。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束前的24 h對大菱鲆進(jìn)行饑餓處理，隨后對各組大菱鲆幼魚進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。隨機(jī)從每個試驗(yàn)組中選取5尾魚解剖，取其肝胰臟、胃樣品，于-80℃超低溫冰箱保存，用于酶活性的測定。取腸道樣品于-20℃保存，用于腸道益生菌數(shù)量的測定。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 生長指標(biāo)測定

特定生長率（SGR，%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100蛋白質(zhì)效率（PER，%）=（Wt-W0）/Cp×100

存活率（SR，%）=Nt/N0×100

增重率（WG，%）=[（Wt-W0）/W0]×100

飼料系數(shù)（FCR）=C/（Wt-W0）

式中：Wt——試驗(yàn)大菱鲆終末平均體重（g）；

W0——試驗(yàn)大菱鲆的初始平均體重（g）；

t——飼養(yǎng)天數(shù)（d）；

Cp——蛋白質(zhì)攝食量（干重，g）；

Nt——試驗(yàn)終末大菱鲆數(shù)量；

N0——試驗(yàn)初始大菱鲆數(shù)量；

C——總攝食量（g）。

1.5.2 飼料營養(yǎng)成分測定

飼料水分采用105℃烘箱干燥法測定；粗脂肪采用索氏抽提法測定；粗蛋白采用凱氏定氮法測定；粗灰分采用550℃馬弗爐灼燒法測定[13]。

1.5.3 飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化率測定

消化率采用三氧化二鉻指示劑法進(jìn)行測定[14]。

1.5.4 消化酶活性測定

大菱鲆肝胰臟的淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶及胃組織的胃蛋白酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.5.5 腸道細(xì)菌數(shù)量的測定

使用稀釋平板計(jì)數(shù)法[12]分別計(jì)算大菱鲆腸道中酵母菌、乳酸菌和總細(xì)菌的數(shù)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果以”平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并使用Ex?cel 2010、SPSS 22.0分析軟件和Origin作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)各試驗(yàn)組差異顯著時，再通過Duncan’s法多重檢驗(yàn)判斷各組之間有無差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚生長和飼料系數(shù)的影響（見表2）

由表2可以看出，復(fù)合益生菌粉的添加對大菱鲆幼魚特定生長率、存活率、增重率的影響均差異不顯著（P>0.05），但添加0.2%和0.4%復(fù)合益生菌粉的T1組和T2組，增重率和特定生長率有增加的趨勢。與對照組相比，添加復(fù)合益生菌粉不能顯著降低大菱鲆幼魚的飼料系數(shù)。

表2 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚生長和飼料系數(shù)的影響（n=3）

2.2 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚消化的影響

2.2.1 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚消化酶活性的影響（見圖1）

圖1 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚消化酶活性的影響（n=3）

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)含有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），含有相同字母或無字母表示差異不顯著（P>0.05）。

與對照組和其他試驗(yàn)組相比，添加0.6%的復(fù)合益生菌粉顯著提高了大菱鲆幼魚肝胰臟的淀粉酶活性（P<0.05），添加0.2%、0.6%的復(fù)合益生菌粉顯著提高了大菱鲆幼魚肝胰臟的脂肪酶活性（P<0.05），添加0.2%、0.4%、0.6%的復(fù)合益生菌粉顯著提高了大菱鲆幼魚肝胰臟的胰蛋白酶活性（P<0.05），添加0.4%的復(fù)合益生菌粉顯著提高了大菱鲆幼魚胃組織的胃蛋白酶活性（P<0.05）。

2.2.2 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚飼料消化率的影響（見圖2）

圖2 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚消化率的影響（n=3）

與對照組相比，復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚飼料脂肪消化率無顯著提高作用（P>0.05）；與對照組和其他試驗(yàn)組相比，添加0.2%、0.4%、0.6%的復(fù)合益生菌粉顯著提高大菱鲆幼魚飼料蛋白質(zhì)消化率（P<0.05），添加0.4%、0.6%的復(fù)合益生菌粉顯著提高大菱鲆幼魚飼料干物質(zhì)消化率（P<0.05），并隨著復(fù)合益生菌添加量的增加而升高，達(dá)到最大值后又下降。

2.3 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚腸道中細(xì)菌數(shù)量的影響（見圖3）

圖3 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚腸道中細(xì)菌數(shù)量的影響(n=3)

如圖3所示，與對照組相比，添加0.2%和0.4%的復(fù)合益生菌粉顯著提高大菱鲆幼魚腸道中酵母菌的數(shù)量（P<0.05），添加0.4%的復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚腸道中乳酸菌和細(xì)菌總數(shù)數(shù)量有顯著性影響（P<0.05），整體趨勢為：隨著復(fù)合益生菌粉添加量的增加大菱鲆幼魚腸道中細(xì)菌總數(shù)、酵母菌、乳酸菌的數(shù)量先增加后減少。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚生長性能的影響

研究表明，復(fù)合益生菌粉能促進(jìn)刺參（Aposticho?pus japonicus）的生長，其添加量為0.8%時刺參的生長較好[15]。與飼喂單一益生菌相比，在大菱鲆幼魚飼料中添加復(fù)合益生菌對生長具有顯著的促進(jìn)作用（P<0.05）[16]。然而本試驗(yàn)使用的復(fù)合益生菌粉并不能顯著提高大菱鲆幼魚的特定生長率、存活率和增重率（P>0.05）。這可能與試驗(yàn)所用水產(chǎn)動物種類、復(fù)合益生菌的菌種和數(shù)量等有關(guān)。

3.2 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚消化酶活性和腸道細(xì)菌數(shù)量的影響

水產(chǎn)動物飼料中添加芽孢桿菌可以提高其消化酶活性，促進(jìn)動物生長[17-18]。Gatesoupe[19]認(rèn)為這可能是由于其分泌豐富的胞外消化酶類對水產(chǎn)動物有輔助消化作用的緣故。嗜酸乳桿菌具有較高的蛋白質(zhì)水解酶活性[20]，這也可能有輔助消化作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚腸道的消化酶活性產(chǎn)生了顯著提升作用。當(dāng)復(fù)合益生菌粉添加量為0.6%，大菱鲆幼魚肝胰臟的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性顯著增高；當(dāng)復(fù)合益生菌粉添加量為0.4%，顯著提高其胃組織的胃蛋白酶活性。這些結(jié)果和華雪銘等[21]的研究一致，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）的基礎(chǔ)飼料中添加地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可顯著提高腸道的消化酶活性。類似的，王彥波等[22]研究也發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼料中添加一定濃度的益生菌對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的消化酶活性有促進(jìn)作用并調(diào)節(jié)腸道菌群變化，利于養(yǎng)分的消化吸收[23]。

試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌粉添加量為0.4%時顯著增加了大菱鲆腸道內(nèi)的酵母菌、乳酸菌和細(xì)菌總數(shù)的數(shù)量。酵母菌、乳酸菌等菌群的產(chǎn)酸活動能降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH，對腸壁消化腺的代謝分泌有促進(jìn)作用，使消化酶的分泌量增多，增強(qiáng)消化酶活性[5-7]。酵母菌還能提高脂肪酶和蛋白酶在分子水平上的表達(dá)，增強(qiáng)腸道功能，促進(jìn)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用[24]。因此，本研究提示腸道益生菌數(shù)量的增加很可能是促進(jìn)消化酶活性的重要原因。

3.3 復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚飼料消化率的影響

大多數(shù)益生菌粉的益生作用主要體現(xiàn)在防治消化道疾病和幫助消化吸收等方面[25-26]，但有關(guān)復(fù)合益生菌對大菱鲆消化率影響的研究鮮有報道。本研究則表明復(fù)合益生菌粉對大菱鲆幼魚脂肪消化率無顯著提高作用，這很可能是由于食用復(fù)合益生菌粉后腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量得到了提高，而乳酸菌對脂肪吸收產(chǎn)生阻礙作用[27]。此外，添加0.4%、0.6%的復(fù)合益生菌粉顯著提高了大菱鲆飼料干物質(zhì)消化率，并呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。這和前人的研究一致，適量添加復(fù)合益生菌可以顯著提高羅非魚[28]、大西洋鮭[9]飼料營養(yǎng)的消化率，而過量添加則會使消化率下降。這可能是由于添加的復(fù)合益生菌濃度過大時，會造成微生物之間的競爭，進(jìn)而導(dǎo)致種群的衰落。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，在大菱鲆幼魚日糧中添加適量的復(fù)合益生菌粉可顯著提高蛋白質(zhì)消化率和飼料干物質(zhì)消化率，并顯著增強(qiáng)淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的活性，其適宜添加量為0.4%。