王桂芳， 呂凱歌

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院國家口腔醫(yī)學(xué)中心，上海口腔醫(yī)學(xué)先進(jìn)技術(shù)與材料工程技術(shù)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011）

鎂是人體含量最豐富的金屬元素之一，對(duì)維持骨骼健康起重要的作用。鎂離子促進(jìn)骨再生/骨結(jié)合作用與材料表面局部鎂濃度高于骨組織細(xì)胞間的基礎(chǔ)生理濃度相關(guān)[1]。流行病學(xué)研究認(rèn)為，血鎂濃度的增加有利于骨密度的提高[2]，而骨密度的提高有賴于骨相關(guān)細(xì)胞礦化沉積，提示鎂離子濃度的增加可能有利于骨相關(guān)細(xì)胞的成骨向分化、礦化。以往的鎂離子研究常圍繞高濃度開展[3]，學(xué)者們認(rèn)為2～10 mmol/L濃度的鎂離子對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞成骨向分化、礦化具有積極作用[4]。然而人體血鎂正常濃度范圍為0.8～1.2 mmol/L，鎂濃度高于1.25 mmol/L會(huì)發(fā)生高鎂血癥，體外研究的2～10 mmol/L濃度鎂離子并不適用于人體實(shí)際的生理情況。闡明生理范圍內(nèi)鎂離子濃度的變化對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）成骨分化活性的作用及相關(guān)分子機(jī)制具有重要意義。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，可將包括受損大分子和細(xì)胞器的胞質(zhì)成分傳遞至溶酶體進(jìn)行降解和再循環(huán)，在細(xì)胞和生物體的生長生存、成熟分化和穩(wěn)態(tài)維持等各方面起到非常重要的作用[5]?，F(xiàn)階段研究認(rèn)為，細(xì)胞自噬高度參與成骨細(xì)胞的礦化過程，自噬還與細(xì)胞分泌機(jī)制密切相關(guān)，自噬泡可作為媒介包裹針狀礦物晶體將其由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，參與礦物晶體在胞內(nèi)的運(yùn)輸過程[6]。探討生理范圍內(nèi)鎂離子濃度的變化是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平影響B(tài)MSCs成骨分化、礦化，有助于闡明其具體作用機(jī)制。

本研究擬在常規(guī)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含0.8 mmol/L鎂離子）的基礎(chǔ)上，額外添加鎂離子，將終濃度設(shè)置為0.9、1.0、1.2 mmol/L，形成鎂離子濃度梯度增加培養(yǎng)條件，探討生理范圍內(nèi)鎂離子濃度提高在BMSCs成骨分化中的調(diào)控作用，并初步探索鎂離子調(diào)控BMSCs成骨分化、礦化的潛在分子機(jī)制，為闡明生理濃度鎂離子濃度的變化在成骨分化、礦化中起到重要作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶（上海源培生物科技有限公司，中國）；胎牛血清 （fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Biological Industries公司，以色列）；四甲基偶氮唑鹽（MTT；Invitrogen公司，美國）；二甲基亞砜（DMSO；上?？捣€(wěn)生物科技有限公司，中國）；多聚甲醛、曲拉通X-100（國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，中國）；堿性磷酸酶試劑盒、增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒、AdPlus-mCherry-GFPLC3B、anti-OCN抗體、anti-LC3 I/II、anti-Beclin-1、anti-p62抗體（碧云天生物技術(shù)研究所，中國）；地塞米松、β-甘油磷 酸 二鈉、Vitamin C、P-硝 基 苯磷 酸（Sigma公司，美國）；BCA蛋白檢測試劑盒（Thermal Fisher Scientific，美國）；TRIzol試劑，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑、Real-time PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）（上海江萊生物科技有限公司，中國）。

電子分析天平（Sartorius，德國）；電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國）；高壓蒸汽消毒鍋（Tomy公司，日本）；微量可調(diào)移液器（Eppendorf公司，德國）；超凈工作臺(tái)（Bio-Hazard，中國）；恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus公司，美國）；-20℃冰箱（海爾集團(tuán)，中國）；高速低溫離心機(jī)（Thermo Elemental公司，美國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Tecan公司，瑞士）；Real-time PCR儀（羅氏，瑞士）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.2 大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)

本研究采用全骨髓貼壁法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[7]。SD大鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。取4周SD大鼠，將100 g/L水合氯醛按3 mL/kg的劑量腹腔注射麻醉。麻醉顯效后，用75%乙醇浸泡消毒，摘取大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，去除周圍軟組織，剪開骨干端，用注射器抽取10 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液沖洗骨髓腔并收集至離心管中，反復(fù)吹打混勻后接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、95%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次換液，待貼壁細(xì)胞增殖到約70%～80%融合度后用0.25%胰蛋白酶傳代培養(yǎng)，第2～3代細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.3 鎂離子對(duì)大鼠BMSCs代謝活性的影響

采用MTT法檢測鎂離子對(duì)大鼠BMSCs增殖能力的影響[8]。將BMSCs按照5 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)4 h，更換為新鮮配制的添加不同濃度鎂離子（100、200、400μmol/L）的成骨誘導(dǎo)液（含地塞米松100 nmol/L，β-甘油磷酸二鈉2.16 g/L，Vitamin C 50 mg/L），分別記為Mg 100μmol/L組，Mg 200μmol/L組和Mg 400μmol/L組；對(duì)照組成骨誘導(dǎo)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次。第1、4、7天，每孔分別加入10μL的MTT液（5 mg/mL），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入200μL的二甲基亞砜，振蕩均勻使結(jié)晶物充分溶解，用多功能酶標(biāo)儀檢測540 nm的吸光度值，以630 nm的吸光度值為參照。

1.4 堿性磷酸酶染色和半定量檢測

將BMSCs按照2×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板。按1.3步驟培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和活性檢測。ALP染色：按照堿性磷酸酶染色試劑盒使用說明書配制染液，避光條件下室溫染色05 h，充分漂洗后掃描記錄。ALP半定量：每孔加入500μL堿性磷酸酶裂解液，37℃恒溫箱裂解4 h，取50μL上清液并加入等體積的ALP底物反應(yīng)液，于恒溫箱繼續(xù)反應(yīng)30 min，多功能酶標(biāo)儀檢測405 nm的吸光度值。BCA蛋白檢測試劑盒檢測細(xì)胞總蛋白濃度，計(jì)算相應(yīng)的堿性磷酸酶相對(duì)活性。

1.5 茜素紅染色及半定量分析

將BMSCs按照6×104個(gè)/孔的密度接種于12孔板，按1.3步驟培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后全部更換為普通成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)至21 d。各組常規(guī)固定、沖洗，0.5%茜素紅染液染色1 h，充分漂洗后掃描記錄。然后每孔加入新鮮配制的10%十六烷基氯化吡啶溶液，振蕩器上振蕩溶解，多功能酶標(biāo)儀檢測590 nm的吸光度值。BCA蛋白檢測試劑盒檢測平行對(duì)照組細(xì)胞總蛋白濃度，計(jì)算相應(yīng)的茜素紅染色半定量分析。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量檢測

將BMSCs按照1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，按1.3步驟培養(yǎng)。7 d后TRIzol提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA作為模板，采用Real-time PCR檢測成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN（骨鈣素）、OPN（骨橋素）、BMP-2的表達(dá)以及鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MagT1基因的表達(dá)，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gluceraldehyde-3-phosphate dehydro genase，GAPDH）的表達(dá)量為參照。

1.7 激光共聚焦檢測OCN、LC3蛋白表達(dá)

將直徑為20 mm的細(xì)胞爬片放置于12孔板中，按照5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，按1.3步驟培養(yǎng)4 d。4%多聚甲醛固定，PBS漂洗，0.2%TritonX-100處理20 min，PBS漂洗，1%BSA封閉30 min，anti-OCN抗體、anti-LC3抗體1:100稀釋后4℃過夜孵育，PBS漂洗，熒光二抗1:200稀釋后室溫孵育30 min，PBS漂洗，鬼筆環(huán)肽溶液染色90 min，PBS漂洗，4′，6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚 （4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）對(duì)細(xì)胞染色15 min，PBS漂洗，用防淬滅封片劑封片后激光共聚焦顯微鏡拍照記錄。

1.8 Western Blot檢測OCN蛋白、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

按1.3步驟培養(yǎng)各組細(xì)胞4 d，收集蛋白樣本進(jìn)行Western Blot檢測。具體操作如下：采用蛋白提取試劑盒裂解細(xì)胞提取蛋白，使用BCA試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。將等量各組蛋白樣品上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacryl-amide gel electroph-oresis，SDS-PAGE）凝膠，進(jìn)行電泳分離，然后通過電轉(zhuǎn)移到預(yù)激活的PVDF膜。將膜分別與一抗anti-OCN、anti-LC3Ⅰ/Ⅱ、anti-Beclin-1、anti-p62抗體在4℃條件下孵育過夜。然后將膜與HRP標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在UVItec ALLIANCE 4.7凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，并對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析計(jì)算。以β-actin作為參照物，各目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin灰度值比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染

自噬雙標(biāo)腺病毒AdPlus-mCherry-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染用于觀察鎂離子作用條件下BMSCs自噬流變化情況。BMSCs預(yù)先接種于細(xì)胞爬片上，按照20 MOI轉(zhuǎn)染BMSCs，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h普通熒光顯微鏡下觀察，待明確轉(zhuǎn)染成功后更換為成骨誘導(dǎo)液、添加200μmol/L鎂離子成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

1.10 熒光素酶法檢測腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）含量

將BMSCs按照1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，按1.3步驟培養(yǎng)。第3、6天，每孔加入200μL細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打收集，4℃12 000 r/min離心5 min，取上清液。按照增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測吸光度值，BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定各組細(xì)胞總蛋白濃度，計(jì)算各組胞內(nèi)ATP濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，在正態(tài)分布和方差齊性條件下采用單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA）和SNK post hoc等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鎂離子對(duì)大鼠BMSCs代謝活性的影響

大鼠BMSCs在不同鎂離子環(huán)境下培養(yǎng)1、4、7 d后，MTT法檢測細(xì)胞總代謝情況。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，鎂離子添加各組（100、200、400μmol/L）細(xì)胞總代謝活性均增加，與對(duì)照組細(xì)胞代謝活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示該濃度范圍的鎂離子對(duì)細(xì)胞的增殖活性無抑制作用（圖1）。

圖1 不同鎂離子濃度條件下細(xì)胞培養(yǎng)1、4、7 d后MTT檢測細(xì)胞代謝活性Figure 1 The metabolic activity of BMSCs cultured in different magnesium ion concentration was measured by MTT assay

2.2 鎂離子對(duì)大鼠BMSCs成骨分化、礦化的影響

大鼠BMSCs在不同鎂離子條件下培養(yǎng)7 d后，ALP染色及半定量檢測結(jié)果如圖2所示，100、200、400μmol/L鎂離子濃度組細(xì)胞的ALP染色較對(duì)照組更深；100、200μmol/L組ALP蛋白活性較對(duì)照組顯著增加（P<0.01）；400μmol/L組ALP活性較對(duì)照組有一定程度的增加，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 不同鎂離子條件下大鼠BMSCs培養(yǎng)7 d后堿性磷酸酶染色及半定量檢測Figure 2 After 7 days of culture in different magnesium ion concentration,BMSCs were stained with alkaline phosphatase kit,and alkaline phosphatase activity was measured by quantitative assay

大鼠BMSCs在不同鎂離子條件下培養(yǎng)6 d后，更換普通成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)至21 d，茜素紅染色及半定量分析檢測細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積情況。結(jié)果如圖3所示，100、200、400μmol/L組細(xì)胞的茜素紅染色更深（圖3A）；各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞外鈣鹽沉積均較對(duì)照組增加，其中Mg 100μmol/L組和Mg 400μmol/L的鈣鹽沉積與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Mg 100μmol/L組的鈣鹽沉積效果最佳。

圖3 不同鎂離子培養(yǎng)條件下大鼠BMSCs茜素紅染色及半定量檢測Figure 3 Alizarin Red staining and matrix mineralization semiquantitative assay were performed after BMSCs cultured in different magnesium ion concentration

2.3 鎂離子對(duì)大鼠BMSCs成骨分化相關(guān)基因及MagT1基因表達(dá)的影響

BMSCs在不同鎂離子濃度條件下培養(yǎng)，7 d后Real-time PCR檢測成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、BMP-2、OPN以及鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MagT1基因相對(duì)表達(dá)量。Real-time PCR結(jié)果如圖4所示，Mg 100μmol/L組和Mg 400μmol/L組的ALP基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組無顯著差異，Mg 200μmol/L組的ALP基因表達(dá)量較對(duì)照組增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Mg 100μmol/L組和Mg 200μmol/L組的OCN基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中Mg 200μmol/L組相對(duì)表達(dá)量最高（P<0.01）；Mg 400μmol/L組的OCN基因表達(dá)量較對(duì)照組增加，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Mg 100、200和400μmol/L組的OPN、BMP2基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組提高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中Mg 200μmol/L組的OPN、BMP2基因相對(duì)表達(dá)量最高（P<0.01）。鎂離子添加3組的MagT1的基因相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組提高（P<0.01），其中Mg 200μmol/L組MagT1的基因相對(duì)表達(dá)量最高。

圖4 不同鎂離子條件下培養(yǎng)細(xì)胞7 d后Real-time PCR檢測成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、OPN、BMP-2和鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MagT1基因的表達(dá)情況Figure 4 After 7 days′culture in different magnesium ion concentration,expression of osteogenic related differentiation genes(ALP,OCN,OPN,BMP-2)and MagT1 were detected by Real-time polymerase chain reaction

2.4 激光共聚焦檢測OCN、LC3蛋白表達(dá)情況

激光共聚焦檢測BMSCs在不同鎂離子條件下培養(yǎng)4 d后OCN蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。對(duì)照組OCN蛋白熒光染色強(qiáng)度低，Mg 100、200、400μmol/L組OCN蛋白免疫熒光染色均有一定程度增強(qiáng)，其中Mg 200μmol/L組OCN蛋白熒光染色最強(qiáng)。

圖5 細(xì)胞在不同鎂離子條件下培養(yǎng)4 d后激光共聚焦檢測OCN蛋白免疫熒光染色情況（×200）Figure 5 Expression of OCN was observed by immunofluorescent staining after 4 days'culture in different magnesium ion concentration(×200)

激光共聚焦檢測BMSCs在不同鎂離子條件下培養(yǎng)4 d后LC3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示。對(duì)照組LC3蛋白熒光染色強(qiáng)度低，分布彌散，Mg 200μmol/L組LC3蛋白免疫熒光染色增強(qiáng)，分布成斑點(diǎn)狀。

圖6 細(xì)胞在不同鎂離子條件下培養(yǎng)4 d后激光共聚焦檢測LC3蛋白免疫熒光染色情況（×630）Figure 6 Expression of LC3 protein was observed by immunofluorescent staining after 4 days'culture in different magnesium ion concentration(×630)

2.5 鎂離子對(duì)細(xì)胞OCN蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western Blot檢測BMSCs在不同鎂離子條件下培養(yǎng)4 d后OCN蛋白及自噬關(guān)鍵性蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示。添加100、200、400μmol/L濃度的鎂離子后，BMSCs細(xì)胞OCN蛋白、自噬相關(guān)LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表達(dá)量均有一定程度的提高，其中Mg 200μmol/L組OCN蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白條帶染色最深，Beclin-1蛋白條帶染色隨著鎂離子濃度增高逐漸變深，p62蛋白條帶在Mg 100μmol/L組有一定增加，Mg 200μmol/L組和Mg 400μmol/L組條帶顏色變淺。與內(nèi)參灰度值比較分析后，鎂離子添加各組OCN蛋白、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白灰度值比均增加，其中Mg 200μmol/L組的灰度值比最高。與對(duì)照組相比，鎂離子作用各組Beclin-1蛋白灰度值比均有一定程度增加，其變化與鎂離子增加趨勢(shì)一致，p62蛋白在Mg 100μmol/L組灰度值比增加，在Mg 200μmol/L和Mg 400μmol/L組灰度值比降低，其中Mg 100μmol/L組灰度值比最低。

圖7 細(xì)胞在不同鎂離子條件下培養(yǎng)4 d后Western Blot檢測OCN蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平及半定量分析Figure 7 After 4 days′incubation,expression of OCN and autophagy related proteins were measured by Western Blot.Band densities of OCN and autophagy related proteins were normalized

2.6 自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染觀察自噬流

激光共聚焦顯微鏡觀察自噬雙標(biāo)腺病毒AdPlus-mCherry-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染BMSCs后自噬流變化。對(duì)照組mCherry標(biāo)記的紅色熒光和GFP標(biāo)記的綠色熒光彌散分布在細(xì)胞中，添加鎂離子后，mCherry標(biāo)記的紅色熒光和GFP標(biāo)記的綠色熒光共表達(dá)呈斑點(diǎn)狀，提示Mg 200μmol/L組的細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)（圖8）。

圖8 熒光雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染觀察BMSCs自噬流（×630）Figure 8 Autophagy flux of BMSCs was observed after AdPlusmCherry-GFP-LC3B was transfected(×630)

2.7 鎂離子對(duì)大鼠BMSCs細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響

BMSCs在不同鎂離子條件下培養(yǎng)3、6 d后，熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。結(jié)果如圖9顯示：細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，各組鎂離子添加組細(xì)胞內(nèi)ATP濃度較對(duì)照組均下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；細(xì)胞培養(yǎng)6 d后，ATP水平繼續(xù)下降，且隨著鎂離子濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度下降增加，其中Mg 400μmol/L組的細(xì)胞內(nèi)ATP水平最低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖9 不同鎂離子條件下培養(yǎng)細(xì)胞3、6 d后熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平Figure 9 Level of intracellular ATP concentration was detected after 3 and 6 days'culture in different magnesium ion concentration

3 討論

鎂離子與骨礦化密切相關(guān)?？山到怄V基植入物可促進(jìn)骨折愈合，植入體內(nèi)后其周圍可觀察到新骨的形成，該促新骨形成作用可能與鎂基植入物在降解過程中表面的局部鎂濃度高于骨組織細(xì)胞間的基礎(chǔ)生理性濃度相關(guān)[9]。人體血鎂正常濃度范圍為0.8～1.2 mmol/L，血鎂濃度低于0.75 mmol/L時(shí)會(huì)發(fā)生低鎂血癥，濃度高于1.25 mmol/L時(shí)會(huì)發(fā)生高鎂血癥，血鎂在正常生理范圍內(nèi)的濃度波動(dòng)即可引起骨表面鎂含量的改變，影響骨密度[10]。在以往的研究中，學(xué)者們往往關(guān)注高濃度鎂離子對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞的成骨向分化、礦化的調(diào)控作用[11]。超過生理濃度范圍的高濃度鎂離子并不符合機(jī)體的實(shí)際生理情況。在本研究中，我們?cè)诔Ｒ?guī)培養(yǎng)液（鎂離子濃度為0.8 mmol/L）基礎(chǔ)上，分別添加100、200、400μmol/L的鎂離子，形成鎂離子終濃度分別為0.9、1.0、1.2 mmol/L的培養(yǎng)液，模擬人體生理范圍內(nèi)鎂離子濃度變化。將濃度生理范圍內(nèi)變化的鎂離子作用于大鼠BMSCs，通過多種手段檢測鎂離子對(duì)BMSCs的成骨分化、礦化作用，并探索其相關(guān)機(jī)制。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)生理濃度范圍內(nèi)鎂離子的增加能夠促進(jìn)ALP、OCN在基因和蛋白水平表達(dá)的提高。ALP、OCN在成骨細(xì)胞分化不同階段具有重要的標(biāo)志性意義，證實(shí)鎂離子對(duì)BMSCs具有明確的成骨誘導(dǎo)活性，增強(qiáng)BMSCs的成骨分化能力，促進(jìn)細(xì)胞外鈣鹽沉積，促進(jìn)礦化。

細(xì)胞外基質(zhì)礦化是受到細(xì)胞內(nèi)分子調(diào)節(jié)的由囊泡介導(dǎo)的礦化過程，自噬泡可作為媒介運(yùn)輸胞內(nèi)礦物晶體參與礦化過程[12]。本研究首次發(fā)現(xiàn)生理濃度范圍內(nèi)，鎂離子的增加可促進(jìn)自噬關(guān)鍵性蛋白LC-3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達(dá)，提示鎂離子通過促進(jìn)自噬小體形成增加，激活早期自噬調(diào)控BMSCs成骨分化、礦化行為。

mTOR是自噬的重要調(diào)節(jié)分子，mTOR受到AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)促進(jìn)自噬。AMPK是一種重要的細(xì)胞內(nèi)能量傳感器，能夠感知細(xì)胞的低能量水平，受到細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP和ADP/ATP比值的精確調(diào)控[13]。當(dāng)細(xì)胞處于正常生理狀態(tài)時(shí)，ATP與ADP、AMP的比值較高。高水平的ATP結(jié)合到AMPK并抑制其活性。高AMP/ATP比值時(shí)，AMPK的α亞單位內(nèi)Thr-172發(fā)生磷酸化激活A(yù)MPK。ATP作為最重要的能量分子，在細(xì)胞的各種生理、病理過程中起著重要作用，ATP水平的改變會(huì)影響細(xì)胞的功能[14]。ATP是以Mg2+-ATP的形式參與反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)鎂的變化直接影響到線粒體的功能及能量代謝[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，生理范圍內(nèi)鎂離子濃度的增加會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平。ATP水平的降低有3種可能，一方面可能是ATP的合成受阻，另一方面可能是ATP的分解加快，還有一種可能是2種情況同時(shí)發(fā)生。無論什么原因造成細(xì)胞內(nèi)ATP濃度下降，均可能激活細(xì)胞能量傳感器的AMPK。因而我們大膽推測：鎂離子通過影響細(xì)胞能量代謝降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平活化AMPK，進(jìn)一步抑制自噬負(fù)性調(diào)控因子mTOR激酶磷酸化，從而激活細(xì)胞自噬，調(diào)控BMSCs的成骨分化、礦化作用，該分子機(jī)制推測尚需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

細(xì)胞內(nèi)鎂，尤其是游離的Mg2+在酶促反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能[16]。細(xì)胞內(nèi)鎂平衡主要是通過存在于細(xì)胞膜上的各種鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)的。MagT1廣泛存在于各組織細(xì)胞膜上，是鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)特異性最高的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]，在BMSCs成骨分化過程中起重要作用。在本研究中我們證實(shí)，鎂離子濃度增加100μmol/L即可誘導(dǎo)大鼠BMSCs的MagT1基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，濃度增加200μmol/L進(jìn)一步增強(qiáng)MagT1基因表達(dá)，提示MagT1可能是鎂離子激活自噬促進(jìn)BMSCs成骨分化、礦化作用的靶蛋白，該推測有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，生理范圍內(nèi)鎂離子濃度的增加對(duì)大鼠BMSCs代謝活性無明顯影響，對(duì)BMSCs具有明確的成骨誘導(dǎo)活性，增強(qiáng)BMSCs的成骨分化、礦化能力，其作用機(jī)制可能與MagT1表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞ATP水平降低，自噬激活相關(guān)。本研究為鎂離子在骨向分化、礦化中起的重要作用及相關(guān)作用機(jī)制提供新觀點(diǎn)，為鎂及鎂基植入材料、鎂離子改性材料研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。