郭冰玉，左洋洋，王先科，李 莉

（1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院，鄭州 450044）

細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見、危害最大的一類疾病，隨著高密度集約化養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，在養(yǎng)殖產(chǎn)量提高的同時，也導(dǎo)致了魚病頻發(fā)的現(xiàn)象。細(xì)菌性爛鰓病、細(xì)菌性腸炎、細(xì)菌性敗血癥、豎鱗病和赤皮病的暴發(fā)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者帶來慘重的經(jīng)濟(jì)損失?？股厥侵委熂?xì)菌性疾病的常用藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常常由于長期不規(guī)范的使用，導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，水產(chǎn)品藥物的殘留以及水體環(huán)境污染和微生態(tài)平衡的破壞等問題[1]。近年來有關(guān)中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的相關(guān)研究表明，中草藥含有的生物堿、有機(jī)酸、多糖等免疫活性成分，可以參與調(diào)節(jié)魚類營養(yǎng)代謝，提高魚類免疫力。且對水體不會產(chǎn)生污染，是具有開發(fā)應(yīng)用潛力的替抗產(chǎn)品[2]。

厚樸(Magnolia officinal is Rehd.et.Wils.)為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮、枝皮[2]。厚樸總酚是提取中藥厚樸的酚類化合物，主要包括厚樸酚與和厚樸酚兩種有效活性成分，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中主治人的食積氣滯、腹脹便秘、濕阻中焦、痰壅氣逆和脘痞吐瀉等[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)厚樸具有廣譜抗菌作用，對葡萄球菌(Staphyl ococcussp.)、溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolytic)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)等革蘭氏陽性菌以及炭疽桿菌(Baci llus anthraci)、痢疾桿菌(Shigell a Cast ellani)、傷寒桿菌 (Salmonella typhi)、副傷寒桿菌(Salmonella enterica)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(proteus species)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等革蘭氏陰性菌均有抗菌作用，抗菌性能比較穩(wěn)定[4]。

在厚樸提取物中酚類的抑菌效果較好，吳維萍(2008)在厚樸提取物對不同病原菌抑菌效果的研究中表明，厚樸提取物與厚樸酚對鏈球菌(St reptococcussp.)MIC分別為12.58μg/片、6.29μg/片[5]，林桂蕓(2003)的研究表明和厚樸酚對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、Streptococcus的最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)均在l0 mg·L-1以內(nèi)[6]。在已有的研究中，多以陸生動物致病菌為研究對象，而有關(guān)厚樸提取物對水生病原菌的研究鮮有報道。本試驗(yàn)選擇水生病原嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophi la)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和陸生動物病原金黃色葡萄球菌為研究對象，使用倍比稀釋法和平板點(diǎn)菌法測定了厚樸總酚對6種常見致病菌的MIC和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。旨在為厚樸總酚用于水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

供試S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus、E.tarda、A.hydrophila和S.iniae均保存于河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)。

1.1.2 供試藥物及試劑

供試厚樸總酚純度為98%，二甲亞砜（DMSO）、氯化鈉和氫氧化鈉等均為分析純。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的制備

LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉，使用2M NaOH溶液調(diào)pH至7.0～7.2，121℃高壓滅菌后備用。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂粉，121℃高壓滅菌，倒入培養(yǎng)皿待凝固后備用。

1.2.2 藥物預(yù)溶及藥物梯度的配制

根據(jù)厚樸總酚的溶解性，選擇DMSO為溶劑。稱取51.2 mg的粉狀厚樸總酚提取物，溶于1 mL DMSO得到51.2 mg·mL-1的母液。使用LB液體培養(yǎng)基為稀釋液，在試管中做二倍系列稀釋，最終得到濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg·mL-1的厚樸總酚的10個藥物濃度梯度。

1.2.3 菌株活化

從-80℃取出6種待測菌株，用接種環(huán)分別蘸取少許在LB固體培養(yǎng)基上采用四區(qū)劃線法進(jìn)行劃線，分別將S.aureus、V.anguillarum、V.parahemol yticus置于37℃，A.hydrophila、E.tarda置 于28℃，S.iniae于30℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，至培養(yǎng)皿中長出單菌落后備用。

1.2.4 菌懸液的制備

分別從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落于1 mL LB液體培養(yǎng)基中，S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus37℃，E.tarda、A.hydrophila28℃，S.iniae30℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)6～8 h，之后以1∶100的比例按照以上培養(yǎng)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右備用。

1.2.5 最小抑菌濃度的測定

試驗(yàn)共分為10個濃度組，1個陰性對照和1個陽性對照，所有藥物梯度和陽性對照重復(fù)三個平行。實(shí)驗(yàn)前將1.2.4的菌懸液做適當(dāng)稀釋，調(diào)整菌液濃度為106cfu·mL-1，試驗(yàn)組的每個EP管中加300μL稀釋后的菌液之后，分別依次加入300μL 1.2.2中配置的10個濃度梯度的藥物，每個菌種的每個藥物梯度重復(fù)三個平行；陽性對照為300μL菌懸液和300μL LB液體培養(yǎng)基；陰性對照為600μL的LB液體培養(yǎng)基。6種細(xì)菌的培養(yǎng)條件同1.2.3，恒溫培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行觀察，在所有無肉眼可見白色絮狀物生長的澄清藥物濃度中，濃度最小的藥物梯度為該藥物的MIC。

1.2.6 最小殺菌濃度的測定

取出1.2.5菌藥混合物中MIC的前3～5個藥物梯度，在先前準(zhǔn)備的的LB固體培養(yǎng)基中分別點(diǎn)菌，每個藥物梯度設(shè)置三個平行。將點(diǎn)過菌的LB固體培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)條件同1.2.3培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行觀察，所有不長菌的藥物梯度中最小濃度即為該藥物的MBC。

2 結(jié)果

2.1 厚樸總酚對常見病原菌的抑菌活性

使用倍比稀釋法檢測厚樸總酚對A.hydrophila、E.tarda、V.parahemolyticus、V.anguillarum、S.aureus、S.iniae的敏感性，經(jīng)過培養(yǎng)24 h后，6種病原菌在不同藥物梯度中的生長情況詳見表1。根據(jù)肉眼觀察無白色絮狀生長的澄清培養(yǎng)基中，濃度最小的藥物梯度為厚樸總酚對某種細(xì)菌的MIC，厚樸總酚對S.iniae、S.aureus、V.anguillarum和V.parahemolyticus的MIC分別為16μg·mL-1、16μg·mL-1、32μg·mL-1和64μg·mL-1。而A.hydrophila和E.tarda的所有濃度梯度的EP管中均有白色絮狀物質(zhì)，說明厚樸總酚對這兩種致病菌的MIC均 大 于512μg·mL-1。結(jié) 果 顯 示S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.iniae這四種菌株對厚樸總酚較為敏感，而A.hydrophi la和E.tarda對厚樸總酚不敏感。

表1 厚樸總酚對常見病原菌的抑菌作用

2.2 厚樸總酚對常見病原菌的殺菌活性

根據(jù)厚樸總酚對6種病原菌的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.iniae菌藥混合物中MIC的前3～5個藥物梯度，在LB固體培養(yǎng)基中分別點(diǎn)菌，培養(yǎng)24 h后，觀察平板上菌落的生長情況，結(jié)果顯示厚樸總酚對S.iniae、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.aureus均有不同程度的殺菌作用，MBC分別為32μg·mL－1、64μg·mL－1、128μg·mL－1和256μg·mL－1（表2）。由于A.hydrophila和E.tarda的最小抑菌濃度超過本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最高藥物濃度，則MBC高于512μg·mL－1。

表2 厚樸總酚對6種病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 討論

張?jiān)?2012)研究了厚樸酚對幾種微生物的抑菌作用，結(jié)果顯示厚樸酚對人類常見致病菌S.aureus和E.coli的MIC分別為10μg·mL－1和5μg·mL－1，對人畜－禽共患致病菌沙門氏桿菌(Salmonella.sp)的MIC為5 μg·mL－1，而對植物致病菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)的MIC分別為5 μg·mL－1和10μg·mL－1，對啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MIC為10μg·mL－1[7]，說明厚樸酚具有廣譜抗菌作用且抑菌效果明顯。劉桂蘭等(2018)對厚樸總酚對乳房炎致病菌S.aureus的抑菌作用及抗溶血作用的研究表明，厚樸總酚對S.aureus的MIC范圍為8～16μg·mL－1[8]。而在本試驗(yàn)中，厚樸總酚對S.aureus的MIC為16μg·mL－1，結(jié)果與劉桂蘭和張?jiān)?2012)的研究結(jié)果不完全相同，但差別微小，可能與菌株來源不同、試驗(yàn)方法不同有關(guān)。

梁利國(2010)研究了常用中草藥對4種病原弧菌的體外抗菌效果，結(jié)果顯示，五倍子(Rhus chinensis Mill.)、石榴皮(Granti pericarpium)、蘇木(Caesalpiniasappan Li nn)和地錦草(Euphorbia humifusa Willd.)等對V.anguillarum、V.parahemolyticus、 河 口 弧 菌(V.aestuarianus)以及霍亂弧菌(V.cholerae)等均具有較好 的 抑 菌 和 殺 菌 效 果，MIC為0.78～6.25 mg·mL－1，MBC為3.12～12.5 mg·mL－1[9]，而本研究中厚樸總酚對V.anguill arum和V.parahemol yticus的MIC分別為32μg·mL－1和64μg·mL－1，MBC分別為64μg·mL－1和128μg·mL－1，結(jié)果顯示厚樸總酚的對這兩種弧菌的抑菌和殺菌效果比以上四種中草藥更為顯著。

本研究中厚樸總酚對A.hydrophila的MIC和MBC均大于512μg·mL－1，抑菌效果不明顯。與吳家玉(2021)提出的厚樸酚對嗜水氣單胞菌不具有抑菌或殺菌作用的觀點(diǎn)一致。但是在飼料中添加厚樸總酚投喂異育銀鯽(Carassius auratus gi belio)，卻能夠減少A.hydrophila感染引起的異育銀鯽的死亡，與對照組相比，厚樸酚處理后的異育銀鯽ALT、AST和LDH顯著下調(diào)，TP和ALB含量顯著上升(P＜0.05)，CAT、SOD活性顯著提高，GSH含量顯著提高(P＜0.05)，MDA顯著下降(P＜0.05)，在一定程度上緩解肝臟和脾臟的充血，改善腎臟和腸道的細(xì)胞壞死，說明該藥物可降低異育銀鯽的組織氧化損傷。此外，厚樸酚還可顯著下調(diào)MyD88、NF－κB和TNF－α基因的表達(dá)量，提高TLR－5基因表達(dá)量(P＜0.05)，表明該藥物可通過下調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來發(fā)揮抗炎功能[10]，因此厚樸酚對預(yù)防魚類細(xì)菌感染以及在抗菌免疫中發(fā)揮重要作用，可作為一種免疫增強(qiáng)劑開發(fā)應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，厚樸總酚對S.iniae的MIC(16 μg·mL－1)和MBC(32μg·mL－1)在供試菌株中均為最低，而厚樸總酚對S.aureus的MIC(16μg·mL－1)雖然也較低，但MBC(256μg·mL－1)卻較高，推測厚樸總酚對不同種類細(xì)菌的作用機(jī)制不同，厚樸總酚對S.iniae主要發(fā)揮殺菌作用，而對S.aureus可能發(fā)揮抑菌作用。此外，厚樸總酚對淡水魚致病菌A.hydrophila無明顯抑菌作用，但相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)厚樸總酚對A.hydrophila引起的疾病有一定的緩解作用，因此在面對由A.hydrophila感染引起的疾病時，厚樸總酚可以輔助或替代傳統(tǒng)化學(xué)合成藥物參與治療。

綜上，厚樸總酚作為一種天然中草藥提取物，在抑菌、殺菌以及抗炎方面發(fā)揮作用，可一定程度上替代抗生素和化學(xué)合成類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和改善養(yǎng)殖環(huán)境。本研究為后續(xù)厚樸總酚對水生致病菌感染水生動物后治療效果的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，為厚樸總酚用于水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。