郭思依，孫明娜，董 旭，褚 玥，童 舟，王 梅，高同春，段勁生

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（合肥），合肥 230031）

0 引言

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，農(nóng)藥起到預(yù)防或消滅病、蟲、草及其他有害生物、調(diào)節(jié)植物生長等作用。然而，若施加不當，不僅會破壞生態(tài)環(huán)境、危害人類健康，而且長期施加還容易使病蟲害產(chǎn)生抗藥性。因此，有效監(jiān)測農(nóng)藥殘留并控制在允許范圍內(nèi)，是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)?！禛B 2763—2019食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了食品中483種農(nóng)藥的7107項最大殘留限量，由此可知被允許的農(nóng)藥殘留含量大多處于痕量水平，因此需要較高靈敏度的檢測方法。

前人研究表明農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測的常用方法主要有傳統(tǒng)的色譜法和快速檢測法。色譜法如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等方法選擇性強，可以實現(xiàn)多殘留的同步分離和較低的檢出限。但另一方面，該方法對樣品前處理過程要求較高，檢測時間較長，所需儀器龐大昂貴，不適合大批量樣品測定?？焖贆z測法如酶抑制法、活體生物測定法和免疫分析法。酶抑制法較為成熟，不足之處在于其反應(yīng)過程極易受到環(huán)境因素影響，進而影響檢測結(jié)果；此外，酶抑制法也只對氨基甲酸酯類有機磷農(nóng)藥有效果，這也限制了方法的應(yīng)用范圍?；铙w生物測定法價格低廉、檢測快速，但是需要大量的時間和精力篩選敏感生物，檢測穩(wěn)定性和重復(fù)性也較差。

免疫分析是基于抗體、抗原之間的特異性結(jié)合實現(xiàn)對目標物定量檢測的技術(shù)，具有高靈敏度和選擇性、簡單快速、成本低等優(yōu)勢。為提高農(nóng)藥殘留快速檢測靈敏度、解決傳統(tǒng)方法在快速檢測上的不足，開展基于免疫分析法的農(nóng)藥殘留快檢工作具有重要意義。根據(jù)標記物的不同，本研究綜述了酶聯(lián)免疫吸附分析、熒光免疫分析、免疫層析、免疫磁珠、仿生免疫分析及生物條形碼技術(shù)等，分別介紹探討了這幾種不同的免疫分析技術(shù)的優(yōu)缺點及適用范圍，期望為農(nóng)藥殘留的實驗室和現(xiàn)場檢測提供參考。

1 酶聯(lián)免疫吸附分析法

酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶的高效催化作用相結(jié)合的一種免疫分析技術(shù)。待測物和酶標抗原與固相載體表面的抗體反應(yīng)產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，酶反應(yīng)底物被催化為有色產(chǎn)物的量與待測物含量直接相關(guān)，可據(jù)此進行定性定量分析[1]。

ELISA的檢測方法主要有雙抗體夾心法、捕獲法和競爭法，其中雙抗體夾心法和捕獲法屬于非競爭檢測模式，在此模式下，抗體與目標分析物形成復(fù)合體，檢測信號與目標分析物含量成正相關(guān)，通常適用于大分子抗原的檢測[2]；而農(nóng)藥作為一類單抗原決定簇的小分子化合物，只能和一個抗體結(jié)合，故而通常采用競爭檢測模式，檢測信號與目標分析物含量成負相關(guān)[3]。

ELISA檢測技術(shù)所具有的高特異性和高靈敏度等優(yōu)勢使其廣泛應(yīng)用于食品分析、農(nóng)藥殘留、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。在農(nóng)藥殘留檢測方面，Lan等[4]制備出多殺菌素A的新型單克隆抗體，構(gòu)建了多殺菌素A間接競爭ELISA(icELISA)法監(jiān)測牛奶、水果和蔬菜中的多殺菌素殘留，方法的半抑制濃度(IC50)和檢測下限(LOD,Limit of detection)分別為4.11 ng/mL和0.63 ng/mL。Fang等[5]開發(fā)了一種靈敏的生物素化icELISA法檢測花粉中的啶蟲脒殘留，通過抗啶蟲脒單克隆抗體的生物素化，進一步提高免疫反應(yīng)的靈敏度，LOD為這0.17 ng/mL，加標回收率為81.1%～108.0%。Li等[6]提出一種基于適配體的icELISA(apt-ELISA)法測定水胺硫磷殘留，適配體具有易合成、易存儲等優(yōu)點，利用適配體模擬抗體快速測定水中的水胺硫磷，顯示出較好的的選擇性和較高的靈敏度。ELISA技術(shù)所具有的快速、靈敏、成本低等優(yōu)勢，使其廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測之中并且日趨成熟，但操作不當和背景干擾等也會帶來一定的限制。

2 熒光免疫分析法

熒光免疫分析法(Fluorescence immunoassay,FIA)是以熒光物質(zhì)作為標記物，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致熒光強度發(fā)生變化，以此實現(xiàn)對目標物的定量測定。

2.1 時間分辨熒光免疫分析

時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved Fluorescence Immunoassay,TRFIA)是利用鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物所建立的一種新型的非放射性微量分析技術(shù)。銪(Eu3+)，鋱(Tb3+)和釤(Sm3+)具有窄帶發(fā)射譜線，較大的Stokes位移，高量子產(chǎn)率和長衰變壽命的特性，可以產(chǎn)生強熒光并具有長衰減時間。由于延長了測量時間，并且在短壽命背景熒光衰減之后測定了鑭系元素螯合物發(fā)射的特異性熒光，因此可以消除背景熒光的干擾。較大的Stokes位移也可以有效地消除來自激發(fā)源的干擾。此外，添加熒光增強劑可以使原始熒光增強一百萬倍[7-9]。因此，TRFIA通常比ELISA具有較低的背景和更高的靈敏度。

Xu等[10]開發(fā)了對一類有機磷農(nóng)藥(Ops)具有廣泛特異性的基于單克隆抗體的直接競爭TRFIA法，檢測限低于10 ng/mL，環(huán)境水樣中OPs的加標回收率為74.8%～121.3%，相對標準偏差(RSD)為6.4%～15.1%，方法具有良好的靈敏度，簡便性和快速性。Liu等[11]利用Eu3+標記的抗體作為示蹤劑建立了快速靈敏的TRFIA法測定噻蟲啉，在最佳條件下，TRFIA法的IC50值為2 μg/L，LOD為1.9ng/L，在水、土壤、梨和番茄中的加標回收率為83.4%～121%。由于不同鑭系元素?zé)晒怛衔锏陌l(fā)射波長不同，TRFIA能夠同時測定兩種或多種分析物，Shi[12]等建立了雙標記TRFIA法同時檢測食品和環(huán)境基質(zhì)中的對硫磷和吡蟲啉，將Eu3+和Sm3+作為熒光標記分別與抗吡蟲啉多克隆抗體、抗對硫磷多克隆抗體偶聯(lián)，對硫磷和吡蟲啉的IC50分別為10.87 μg/L、7.08 μg/L，檢出限(IC10)分別為0.025 μg/L、0.028 μg/L。盡管TRFIA的成本比ELISA的成本略高，但其所具有的較低的背景干擾和更高靈敏度使TRFIA技術(shù)可以在痕量水平上監(jiān)測農(nóng)藥殘留，保證農(nóng)產(chǎn)品安全。

2.2 熒光偏振免疫分析

熒光偏振免疫分析法(Fluorescence Polarization Immunoassay,FPIA)是一種競爭性免疫測定方法，通過檢測熒光標記小分子抗原(Tracer)與抗體結(jié)合前后熒光偏振值的變化來間接反映目標分析物的含量[13]。對于農(nóng)藥檢測，可以將特定的示蹤劑與特定的單克隆抗體(mAb)結(jié)合，該mAb會誘導(dǎo)高極化值，一旦包含目標農(nóng)藥的樣品競爭與mAb的結(jié)合，極化值就會迅速減弱。

Liu等[14]基于特定的抗三唑磷單克隆抗體和THBu-EDF熒光示蹤劑開發(fā)了一種快速，均勻且高通量的用于三唑磷檢測的FPIA法，反應(yīng)時間不到10分鐘，檢測限為0.29 μg/L，IC50為3.62 μg/L，在水、糙米、卷心菜和蘋果樣品中的平均加標回收率為72.07%～104.35%。Boroduleva等[15]建立了小麥中噻菌靈和氟醚唑的FPIA法。Xu等[16]利用廣譜單克隆抗體開發(fā)了一種簡單快速、高通量的FPIA法同時測定5種有機磷農(nóng)藥，檢測限低于10 ng/mL，加標蔬菜的回收率為71.3%～126.8%。雷紅濤等[17]建立了一種置換型熒光偏振免疫技術(shù)(DFPIA)檢測水樣中除草劑丁草胺，所謂置換是將熒光示蹤物和抗體預(yù)先混合制備出免疫復(fù)合物，而后加入分析物，經(jīng)短時間反應(yīng)后測定熒光偏振信號，該免疫復(fù)合物可在4℃下穩(wěn)定保存至少一周以上。

由此可見，Tracer合成簡單、條件溫和、用時短，標記熒光素性質(zhì)較穩(wěn)定，過程中無需洗滌，可適用于樣品的快速大量篩選。另一方面，與ELISA相比，F(xiàn)PIA的靈敏度較低，原因可能在于樣品自身的熒光會對檢測產(chǎn)生干擾，而且每種檢測物抗原都要有其相應(yīng)的Tracer，有一定的技術(shù)成本。

2.3 量子點熒光免疫分析

量子點(Quantum dots,QDs)是一種半導(dǎo)體納米晶體，由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成，可以接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光，具有激發(fā)光譜寬發(fā)射光譜窄，顏色可調(diào)，光化學(xué)穩(wěn)定性高，熒光壽命長等熒光特性，可作為優(yōu)越的熒光探針[18]。QDs與免疫測定相結(jié)合，增強了農(nóng)藥檢測的特異性和靈敏度。

Tan等[19]將CsPbBr3QDs嵌入分子印跡聚合物(MIP)中合成MIP/QDs復(fù)合材料，其對辛硫磷具有優(yōu)異的選擇性，LOD為1.45 ng/mL，方法用于馬鈴薯和土壤中辛硫磷的檢測，回收率為86.8%～98.2%。Liao等[20]使用CdSe/ZnS量子點作為標記單克隆抗體的探針，建立了用于識別三唑磷的快速、靈敏的熒光免疫測定法。該測定法在10～25 μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好線性，IC10為0.508 ng/L，水果樣品的加標回收率為82.6%～96.6%。QDs具有寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜，使用同一激發(fā)光源就可實現(xiàn)對不同粒徑量子點的同步檢測，進而實現(xiàn)農(nóng)藥的多重檢測。Jiang等[21]以Fe3O4@SiO2@MIP為仿生抗體，不同發(fā)射波長的CdSe/ZnS量子點為標記，同時測定水果中的甲基對硫磷，毒死蜱和敵百蟲。同樣基于CdSe/ZnS量子點具有的不同發(fā)射波長，建立了同時測定水果和蔬菜中敵百蟲和毒死蜱的直接競爭仿生免疫分析方法[22]。Wang等[23]通過將雙量子點與高活性納米卟啉相結(jié)合，實現(xiàn)雙納米信號放大并針對三種有機磷農(nóng)藥產(chǎn)生不同的顏色變化響應(yīng)，建立了基于熒光可視化的紙質(zhì)傳感器。

通過FIA法測定農(nóng)藥殘留具有較寬的線性范圍，也能表現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性，但檢測分析時易受溫度、溶劑和散射光等外界因素的影響，對環(huán)境因素敏感，因此在應(yīng)用上存在一定局限性。

3 免疫層析法

免疫層析法(Immunochromatography,ICA)是以層析試紙條為載體，將免疫技術(shù)和層析技術(shù)相結(jié)合的檢測方法。試紙條由4個部分組成：樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸收墊，樣品溶液與結(jié)合墊中的標記抗體在毛細管層析作用下，與固定在硝酸纖維素膜上的抗原特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，檢測線因標記物積累而顯色，通過肉眼或儀器判讀結(jié)果[24]。根據(jù)標記物的不同，免疫層析技術(shù)大致可以分為膠體金標記技術(shù)、量子點標記技術(shù)、化學(xué)發(fā)光材料標記技術(shù)、磁性納米材料標記技術(shù)等[25]。

Lan等[26]以膠體金為標記物與廣譜單抗結(jié)合，制備免疫層析試紙條用于檢測水樣中的克百威及3-羥基克百威，方法無需復(fù)雜的樣品前處理并且全過程可在5 min內(nèi)完成，LOD達7～10 ng/mL。朱亮亮等[27]研制出可同時檢測4種有機磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析試紙條，驗證了試紙條的特異性、準確性和穩(wěn)定性，為有機磷農(nóng)藥的大批量檢測提供了有力的工具。此外，Wu等[28]基于CdSe/ZnS量子點的側(cè)流層析試紙條快速直觀地檢測草莓中的苯噻菌酯殘留，可實現(xiàn)加標樣品的多濃度檢測和在紫外燈下的結(jié)果可視化，檢測限為25 μg/L。Yang等[29]設(shè)計一種雙讀數(shù)信號探針的新型化學(xué)發(fā)光免疫層析技術(shù)檢測甲基對硫磷和甲氰菊酯，LOD分別為0.17 ng/mL和0.10 ng/mL。Li等[30]提出了一種基于表面增強拉曼散射(SERS)的免疫層析法，用于兩種擬除蟲菊酯農(nóng)藥氯氰菊酯和氰戊菊酯的雙重檢測，與抗體偶聯(lián)的金納米顆粒(AuNPs)作為SERS底物，通過固定兩條設(shè)計用于檢測兩種農(nóng)藥的測試線，可以實現(xiàn)同時雙重檢測。

ICA法快速直觀，同時試紙條體積小、便于攜帶，這些優(yōu)點使其適用于農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測。當農(nóng)產(chǎn)品經(jīng)過試紙條的初篩后，接近或超過殘留限量的樣品可用更精確的儀器方法進一步測定。因此，ICA加快了檢測進程，提高了檢測效率。

4 免疫磁珠法

免疫磁珠(Immune Magnetic Beads,IMB)由磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)和免疫配基組成（圖1），其中MNPs主要由Fe2O3、Fe3O4等過渡金屬氧化物構(gòu)成且粒徑在納米至微米水平，外部的免疫配基主要是羥基(-OH)、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)等，可以使磁珠與抗體、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)共價結(jié)合[31]。IMB具有超順磁性、較大的比表面積可提供較強的吸附能力[32]，通過結(jié)合酶、金或熒光染料等標記物，可實現(xiàn)分離檢測一體化，具有廣泛的發(fā)展前景。

圖1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)

Du等[33]開發(fā)了一種基于免疫磁珠的酶聯(lián)免疫吸附測定法(IMB-ELISA)，使用羧基功能化的磁性Fe3O4納米粒子(CMNPs)檢測三唑磷，與經(jīng)典ELISA相比，顯著提高了靈敏度，檢出限為0.10 ng/mL，在水果、蔬菜、谷物中的平均回收率為83.1%～115.9%，RSD小于10%。崔涵雨等[34]采用一步水熱法制備出氨基功能化的Fe3O4磁納米粒子，并以戊二醛為交聯(lián)劑與西維因多克隆抗體偶聯(lián)，采用直接法定量檢測西維因含量，測得的IC50為0.077 mg/L，IC15為1.48 μg/L。劉運清等[35]將羧基化磁珠與檢測抗原共價結(jié)合制備磁珠探針，建立基于TMB2+蝕刻金納米棒介導(dǎo)的免疫磁珠ELISA檢測方法用于檢測甲基對硫磷、殺螟硫磷和倍硫磷3種有機磷農(nóng)藥。

IMB提供了大小適當、分散性好、磁化強度高的固相載體免疫反應(yīng)場所，但在制備過程中也有一些諸如產(chǎn)量低、易團聚等瓶頸。因此，在進一步的研究工作中，可以探索磁珠合成的新方法，提高磁珠表面功能化和配體的富集效率，提高磁珠生物相容性以擴大應(yīng)用范圍。

5 仿生免疫分析法

仿生免疫分析是將分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymer,MIP)作為仿生抗體，標記抗原和目標物質(zhì)競爭性結(jié)合MIP洗脫后留下的特異性孔穴，通過檢測與孔穴結(jié)合的探針物質(zhì)的量來確定目標物的含量[36]，MIP的制備過程如圖2所示。MIP與生物抗體相比，具有良好的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，可重復(fù)使用且成本低、易制備。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用到磺酰脲類、有機磷類及植物生長調(diào)節(jié)劑等檢測中，并取得了很好的效果。

圖2 MIP制備示意圖

Zhang等[37]在微流控紙芯片上沉積CdTe得到paper@QDs@MIPs，通過電子轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的熒光猝滅機理對農(nóng)藥2,4-D進行特異性識別和靈敏檢測，2,4-D的結(jié)合使熒光強度在不到18min的時間內(nèi)顯著降低，并且在0.83～100 μM的范圍線性良好，在豆芽中的加標回收率為94.2%～107.0%。Li等[38]建立了毛細管電泳-仿生免疫技術(shù)法檢測敵百蟲，方法靈敏度(IC50)為0.16 mg/L，檢出限(IC15)為 0.13 μg/L。Tang 等[39]基于MIP膜作為抗體模擬物，開發(fā)了一種新型且快速直接競爭的仿生ELISA(cd-BELISA)，用于測定N-甲基氨基甲酸酯殺蟲劑滅多威。洪思慧等[40]以三唑酮為模板，甲基丙烯酸為功能單體，在96孔板表面合成MIP膜，采用仿生酶聯(lián)免疫分析法檢測三唑磷。任蕾[41]采用本體聚合法直接合成了苯磺隆MIP膜并建立仿生酶聯(lián)免疫分析方法，在最佳條件下，方法的IC50為15.77 μg/L，IC15為0.01 μg/L。

以模板分子合成的MIP不僅在高溫高壓、酸堿性等條件下穩(wěn)定性好，而且可以一次合成多次使用，與傳統(tǒng)免疫方法相比基質(zhì)效應(yīng)較小，抗干擾性強，在痕量的農(nóng)藥殘留分析等多個領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。但目前對分子識別和作用機理等有待更深一步的研究，同時可以拓展MIP在水溶液或極性溶劑中的應(yīng)用以及在功能單體、交聯(lián)劑種類和聚合方法方面的創(chuàng)新。

6 生物條形碼免疫分析法

生物條形碼技術(shù)(bio-barcode assay,BCA)是基于兩種功能化的納米粒子，金納米顆粒(AuNPs)上修飾有抗體和DNA以捕獲目標物，磁納米顆粒(MNP)用于目標物的分離，通過對解離下來的DNA進行信號放大完成檢測[42]。BCA技術(shù)多用于檢測病毒[43]、致病菌[44]、生物毒素[45]及核酸[46]等大分子物質(zhì)，在體系中可形成AuNPs-目標物-MNP三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合體，釋放DNA后間接測定目標物含量[47]。對于農(nóng)藥等小分子物質(zhì)而言，無法形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，國內(nèi)外關(guān)于BCA應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的報道也很少。

Du等[48]建立了基于微孔板銀染的BCA技術(shù)快速測定蔬菜中的三唑磷農(nóng)藥殘留，結(jié)合生物素親和素系統(tǒng)，加入銀染增強液，在酶標板上通過銀染信號的放大作用實現(xiàn)對解離DNA的定量測定。崔雪妍等[49]將毒死蜱半抗原與雞卵清白蛋白結(jié)合后偶聯(lián)到MNP上，待測物與半抗原競爭結(jié)合AuNPs上的抗體，將DNA解離下來后通過實時熒光定量PCR法檢測，DNA相對量與待檢農(nóng)藥的含量成負相關(guān)，方法的LOD為0.27 μg/L，在蘋果和梨中平均添加回收率為79%～90%；在此基礎(chǔ)上，崔雪妍等[50]又設(shè)計合成了三唑磷、對硫磷及毒死蜱三種農(nóng)藥的膠體金納米探針，建立了基于微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)的有機磷農(nóng)藥多殘留BCA法，ddPCR是一種絕對定量的檢測技術(shù)，與PCR相比具有更高的準確度。

由于納米金較大的比表面積，可標記大量的DNA序列，同時，利用高靈敏度的信號放大技術(shù)對釋放的DNA序列進行定量，保證了BCA法的超高靈敏度。根據(jù)目標物的不同，BCA法可設(shè)置不同序列的DNA進而實現(xiàn)多種目標物的分析。然而，將抗體標記在DNA片段上的過程較難實現(xiàn)且抗體捕捉抗原的速度較慢，導(dǎo)致反應(yīng)時間加長，影響了檢測的靈敏度；條形碼DNA通過PCR擴增也要依賴于昂貴的設(shè)備。因此，探索最佳反應(yīng)條件、進一步簡化操作步驟、降低檢測成本、提高靈敏度以及開發(fā)商業(yè)化免疫試劑盒成為未來研究的重要方向。

7 結(jié)論

免疫分析技術(shù)是以抗原抗體間特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的，常用的酶聯(lián)免疫吸附測定法具有較好的準確性和重復(fù)性，但檢測過程中仍需大量的孵育時間；熒光免疫分析以熒光物質(zhì)作為標記，檢測過程中對環(huán)境因素敏感。與傳統(tǒng)的96孔板固相載體不同，免疫層析試紙條具有體積小、便于攜帶、快速直觀等優(yōu)點，非常適合農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測工作，但靈敏度和精確度普遍較低，大多用于半定量及定性檢測；免疫磁珠具有分散性好、磁化強度高的特點，為避免合成的磁珠產(chǎn)量低、易團聚的缺點，可以探索合成新方法，提高磁珠表面功能化和配體的富集效率，提高磁珠生物相容性以擴大應(yīng)用范圍。而隨著分子印跡技術(shù)、基因檢測技術(shù)的快速發(fā)展，仿生免疫分析和生物條形碼技術(shù)應(yīng)用而生。總之，實現(xiàn)快速、靈敏的農(nóng)藥多殘留檢測將成為免疫分析方法開發(fā)的趨勢。