元 超，舒雪純，張影波，王 凱，謝小麗，徐子琪，袁 媛

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南儋州 571737；2海南大學(xué)林學(xué)院，?？?570228；3山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，濟南 250014；4廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006）

0 引言

艾納香(Blumea balsamifera(L.)DC.)為菊科艾納香屬植物，又名大風(fēng)艾，冰片艾，作為傳統(tǒng)抗菌黎藥有著悠久的用藥歷史[1]。海南民間百姓將其用于刀槍傷口以及婦女的產(chǎn)后沐浴[2]，具有殺菌消炎功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明其具有較好的抗菌活性，鄒婧等[3]研究表明，艾納香提取物能夠很好的抑制白色念珠菌,金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌等口腔細(xì)菌；Wang等[4]對艾納香精油抗菌活性進行研究，結(jié)果顯示艾納香精油對紅毛癬菌具有較強的抑制作用。

植物內(nèi)生真菌是指生活在健康植物體內(nèi)，且不引起明顯植物病理癥狀的一大類微生物[5-6]，藥用植物內(nèi)生真菌一直是農(nóng)用和藥用先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要寶庫[7-8]。目前有關(guān)黎藥植物艾納香內(nèi)生真菌的研究較少，僅唐青等[9]2017年對貴州產(chǎn)艾納香內(nèi)生真菌多樣性進行了研究，共獲得152株內(nèi)生真菌，分屬于11個屬，其中Fusarium，Aspergillus，Trichoderma和Curvularia為其優(yōu)勢菌屬，且不同采集時期和不同采集地的艾納香內(nèi)生真菌種類均具有一定差異。有關(guān)艾納香內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物方面，元超[10]等對分離自海南艾納香植物中的一株Corynespora cassiicolaJ9內(nèi)生真菌進行次生代謝產(chǎn)物的研究，分離得到一個新的縮酚酸環(huán)醚類化合物，此類化合物多具有較強的抗菌活性；從艾納香內(nèi)生真菌Diaporthesp.中獲得dicerandrol類化合物，其對多種病原菌表現(xiàn)出非常好的廣譜抑菌性[11]；Yuan等[12]對一株艾納香內(nèi)生真菌Hypoxylon investiensJ2進行研究獲得了4個結(jié)構(gòu)新穎的α-吡喃酮類化合物，表明艾納香內(nèi)生真菌具有很好的開發(fā)潛力。

炭疽病菌是引發(fā)包括艾納香在內(nèi)的多種植物炭疽病害的重要病原菌。目前炭疽病害的防控以化學(xué)農(nóng)藥為主，為尋找好的生防菌株，進一步開發(fā)為微生物源農(nóng)藥，用于艾納香炭疽病害的生物防控，以及應(yīng)對日益嚴(yán)重的細(xì)菌抗生素耐藥性，對采自海南傳統(tǒng)抗菌黎藥植物艾納香進行內(nèi)生菌分離，鑒定，并對內(nèi)生真菌的抗病原菌活性進行篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 艾納香植株采自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州藥用植物種質(zhì)資源圃，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.。

1.1.2 供試菌株 4株供試炭疽菌菌株：Colletotrichum musae、C.coccodes、C.gloeosporioides、C.fioriniae。

4株供試細(xì)菌菌株：大腸埃希菌(Escherichia coliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisATCC 9372)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 27853)。

所有供試菌中，C.gloeosporioides為本實驗室分離自艾納香葉片組織，并通過回接實驗，證明其具有葉片致病性。其余菌株均由青島大學(xué)藥學(xué)院李剛老師贈送。

1.1.3 培養(yǎng)基 添加鏈霉素的水瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂15 g，鏈霉素100 mg，水1000 mL），PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000 mL），大米培養(yǎng)基（大米60 g，水80 mL，500 mL三角瓶）MHA培養(yǎng)基(Muellerhinton agar)購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物內(nèi)生真菌分離方法 艾納香內(nèi)生真菌的分離采用文獻報道的水瓊脂法[13]，將采集的新鮮組織用自來水沖洗干凈，無菌剪刀剪成0.5x1.0 cm的組織段，超凈臺上用70%乙醇消毒1 min，放入1.3 mol/L的次氯酸鈉溶液中3 min，然后用70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗干凈，接種至水瓊脂培養(yǎng)基中，2周后，挑取組織邊緣長出的新鮮菌絲，接種至PDA平板上進一步純化、培養(yǎng)，獲得的純化菌株保存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株的分子鑒定 艾納香內(nèi)生真菌分別培養(yǎng)3～5天的菌落經(jīng)液氮研磨后采用CTAB法[14]提取基因組DNA，再將提取出來的基因組DNA在PCR儀上進行ITS-rDNA擴增，擴增所用引物為 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ) 和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR擴增反應(yīng)體系為30 μL，擴增的條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72℃最后延伸10 min，12℃保存。將PCR產(chǎn)物送武漢華大基因進行ITS-rDNA測序。返回后，先采用MEGA X[15]軟件去除重復(fù)測序序列和雜合序列，將均勻整齊的序列提交至真菌分子鑒定的數(shù)據(jù)庫UNITE(https://unite.ut.ee)，以E值≤E-10和Bits-score≥1000為鑒定指標(biāo)以確定真菌的種屬地位。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定真菌種屬地位。

1.2.3 粗提物的制備 將菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)10天，無菌條件下將帶菌培養(yǎng)基切塊，接種于制備好的大米培養(yǎng)基中，共3瓶，室溫下靜置培養(yǎng)40天后，加入乙酸乙酯終止發(fā)酵，40 KHz超聲提取3次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮至干，獲得粗提物。

1.2.4 炭疽菌抑制試驗 采用平板對峙法[16]測定艾納香內(nèi)生真菌對4種植物病原炭疽菌的抑制作用。首先將活化好的艾納香內(nèi)生真菌菌株采用點培養(yǎng)法接種于PDA培養(yǎng)基皿對稱位置（距培養(yǎng)皿邊緣約1.5 cm），然后將炭疽菌點接于PDA培養(yǎng)皿的中央，同時以只接炭疽菌的PDA平皿為對照，28℃靜置培養(yǎng)，4～7天后觀察并記錄菌落的生長及抑菌情況，每個處理重復(fù)3次，計算抑菌率，見公式(1)。

1.2.5 細(xì)菌抑菌活性試驗 采用濾紙片法[17]評價了艾納香內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物的抗細(xì)菌活性。將供試細(xì)菌分別用LB培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)過夜，取200 μL加入到無菌MHA平板培養(yǎng)基上，用涂抹棒均勻涂抹，獲得帶菌培養(yǎng)基。將待測提取物分別用甲醇溶解，配置成3 μg/μL的濃度，各取20 μL滴加到直徑6 mm的無菌濾紙片上，揮干溶劑，平貼于帶菌平板培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑，硫酸鏈霉素（1 μg/片）為陽性對照，甲醇為陰性對照，所有實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香內(nèi)生真菌的分離

采用水瓊脂培養(yǎng)基從海南產(chǎn)艾納香不同組織部位中共分離獲得內(nèi)生真菌191株，經(jīng)鑒定歸屬于27個屬，45個種，其中相對多度大于9的菌屬主要有3個，分別為Diaporthe，Colletotrichum和Fusarium，其在根莖葉3個組織部位中均有分布。Trichoderma，Inaequalispora，Clonostachys，Penicillium僅從根中分離得到，Acrocalymma，Alternaria，Boeremia，Corynespora，Periconia，Pleosporales，Diutina，Pestalotiopsis和Muscodor僅分布于葉片組織中，表明部分屬的菌種的分布具有一定的組織偏好或組織特異性（表1）。

表1 艾納香內(nèi)生真菌各屬的菌株數(shù)量和相對多度

2.2 艾納香內(nèi)生真菌對植物病原炭疽菌抑制活性

內(nèi)生真菌與炭疽病菌的平板對峙實驗結(jié)果顯示，供試內(nèi)生真菌中的14株對炭疽菌具有不同程度抑制作用（表2）?？固烤揖钚暂^好的艾納香內(nèi)生真菌有Clonostachys rosea、Corynespora cassiicola、Penicilliumsp.、Fusarium equiseti、Ectophoma pomi和Talaromyces pinophilus。進一步比較發(fā)現(xiàn)Talaromyces、Ectophoma和Penicillium屬內(nèi)生真菌抗炭疽菌活性最為突出（圖1）。

表2 部分內(nèi)生真菌對4株炭疽菌的抑制活性

圖1 部分植物內(nèi)生真菌與炭疽菌的平板對峙實驗結(jié)果

2.3 艾納香內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性

抗細(xì)菌活性顯示，艾納香內(nèi)生真菌中的16株發(fā)酵產(chǎn)物對4種細(xì)菌具有不同程度抑制作用（表3），其中Diaporthe、Fusarium、Penicillium、Phomopsis、Clonostachys、Trichoderma和Inaequalispora屬的內(nèi)生真菌活性較為顯著。進一步分析發(fā)現(xiàn)，艾納香的內(nèi)生真菌Diaporthe phaseolorum和Fusarium equiseti活性尤為突出，其粗提物在濃度為60 μg/片時對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑均顯著大于陽性對照鏈霉素（濃度：1 μg/片）（圖2）。然而，所有供試內(nèi)生真菌對大腸埃希菌的抑制活性均不強。

表3 部分艾納香內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對4株細(xì)菌的抑制作用

圖2 部分植物內(nèi)生真菌粗提物抗4株細(xì)菌試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

唐青等[9]2017年報道的貴州艾納香內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬Fusarium、Aspergillus、Trichoderma和Curvularia，與本研究的結(jié)果有較大差異，推測不同采集地點以及不同的分離方法可能是導(dǎo)致內(nèi)生真菌種類不同的重要原因。本研究采用的內(nèi)生真菌分離方法為水瓊脂法，而唐青等采用的組織切片培養(yǎng)法，組織切片培養(yǎng)法選用的是富營養(yǎng)培養(yǎng)基，分離周期短，優(yōu)勢菌絲生長快，容易蓋住生長緩慢的內(nèi)生真菌[18]；水瓊脂法由于選用的是寡營養(yǎng)的水瓊脂培養(yǎng)基，且添加了可以很好抑制細(xì)菌和放線菌生長的鏈霉素，真菌菌絲生長緩慢，培養(yǎng)周期長，很多非優(yōu)勢菌株也可以生長出來，有利于獲得更多種類的內(nèi)生真菌，更適合植物內(nèi)生真菌的分離。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管來源于同一種植物，然而兩種采集地的艾納香內(nèi)生真菌種類卻有很大差異，由于植物內(nèi)生真菌主要是植物在長期進化中，環(huán)境微生物通過土壤，昆蟲取食，病原菌侵染等途徑進入植物體內(nèi)，并長期定殖下來形成的微生物群落，因此，植物內(nèi)生真菌種類的不同也間接反映了植物所處環(huán)境微生物群落的差異。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序已經(jīng)廣泛的用于評價植物內(nèi)生菌豐度。傳統(tǒng)培養(yǎng)法由于培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件、環(huán)境的限制，會有偏好的選擇樣本中的一些物種，導(dǎo)致一些物種不能生長[22]；其次，在內(nèi)生真菌生長過程中一些生長快的菌株會掩蓋一些生長慢的菌株[23]；另外，部分菌種本身具有體外不可培養(yǎng)性，以上原因均導(dǎo)致對內(nèi)生真菌多樣性評價不夠全面。相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，高通量測序技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、信息量大等特點，極大地推動了人們對微生物生態(tài)學(xué)的認(rèn)識[24]。張愛梅等[25]2019年對中國沙棘根瘤內(nèi)生細(xì)菌進行多樣性分析，結(jié)果共檢測到167科215屬，然而實驗室條件下只分離得到8科8屬共17株內(nèi)生細(xì)菌，說明實驗室條件下單一分離方法獲取菌株對內(nèi)生真菌多樣性的系統(tǒng)評價存在一定局限性。然而單純的高通量測序無法解決內(nèi)生真菌的資源利用方面的實際問題，因此，后續(xù)工作需將不斷完善分離培養(yǎng)方法和技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，深入挖掘內(nèi)生真菌資源。

本研究采用水瓊脂法分離獲得了大量艾納香內(nèi)生真菌，并通過ITS序列分析和比對技術(shù)進行了菌株鑒定，結(jié)果共分離并鑒定191株內(nèi)生真菌，分屬于27屬，45種，其中優(yōu)勢菌屬為Diaporthe，Paraphoma，Ectophoma，Penicillium，Talaromyces，Hypoxylon，Phomopsis，Colletotrichum和Fusarium。通過濾紙片法和平板對峙培養(yǎng)法評價了內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌和抗炭疽菌活性，結(jié)果顯示，Clonostachys,Fusarium和Diapothe屬抗細(xì)菌活性較強，Talaromyces、Ectophoma和Penicillium屬內(nèi)生真菌抗炭疽病菌活性較強。植物炭疽病原菌可危害多種植物，引發(fā)葉片的病斑進而影響光合作用，目前植物炭疽病的防治仍然以化學(xué)防治為主，主要有咪鮮胺，丙環(huán)唑，三唑酮等，然而化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境造成一系列問題，微生物防治具有環(huán)境友好、安全等特點受到廣泛關(guān)注?？咕杷幹参锇{香內(nèi)生真菌目前研究相對較少，現(xiàn)有研究顯示其在農(nóng)用或藥用抗菌先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)方面具有較好的前景[10-12]。本研究的相關(guān)結(jié)果不僅可幫助人們了解海南艾納香內(nèi)生真菌種類情況，而且有助于對活性艾納香內(nèi)生真菌進行次生代謝產(chǎn)物研究，獲得先導(dǎo)化合物，服務(wù)于農(nóng)用病害防治。