石會玲，周宇航，何 平，黃蒙蒙，邵 帥，葛菁萍，凌宏志

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500）

0 引言

乙偶姻(AC)又稱3-羥基丁酮或甲基乙酰甲醇[1]，具有特殊的奶油香味，自然存在于干酪、香蕉、可可、玉米、葡萄、蘋果和肉類等食品中[2-3]，乙偶姻的應(yīng)用范圍極其廣泛，為滿足社會的需求，目前有大量的學(xué)者對于乙偶姻的生產(chǎn)方法及產(chǎn)量進(jìn)行研究[4-5]。微生物以糖類物質(zhì)為底物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻是比較典型的發(fā)酵途徑，葡萄糖通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)被細(xì)胞利用，其中除部分碳源供菌體生長以外，還會形成一系列的中間代謝產(chǎn)物和副產(chǎn)物，如乳酸、乙酸、丁二酸、乙醇、2,3-丁二醇和乙偶姻等[6-7]。在發(fā)酵過程中，這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生不僅消耗了代謝過程中產(chǎn)生的能量，而且對乙偶姻的產(chǎn)量積累產(chǎn)生不利的影響，增加了下游工程中乙偶姻分離純化的難度[8-11]。因此，對乙偶姻代謝支路副產(chǎn)物的相關(guān)關(guān)鍵酶基因敲除成為基因工程改造提高乙偶姻產(chǎn)量的主要策略之一[12-16]。

自殺質(zhì)粒同源重組技術(shù)是將構(gòu)建好的自殺敲除質(zhì)粒，通過細(xì)菌接合的方法進(jìn)入到受體菌中[17]。將擴(kuò)增的外源的目的基因同源重組片段插入到自殺質(zhì)粒當(dāng)中，利用自殺質(zhì)?？梢栽诠w菌中復(fù)制，但不可以在受體菌中復(fù)制特點(diǎn)，通過細(xì)菌接合的方式使自殺質(zhì)粒進(jìn)入到受體菌中[18]。在重組酶的作用下，使自殺質(zhì)粒上的線性打靶片段與染色體的特定目的基因序列發(fā)生同源重組，目的基因被置換下來，然后利用自殺質(zhì)粒上的抗生素篩選標(biāo)記篩選單交換陽性轉(zhuǎn)化子[19-20]。接合同源重組作為一種基因敲除手段，由于接合的方法對于分子量大的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化具有很好的效果、適用范圍廣及敲除效率高等特點(diǎn)在原核生物的菌種改造方面有著極為廣泛的應(yīng)用[21]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的陰溝腸桿菌(E.cloacae)作為出發(fā)菌株，對該菌種進(jìn)行乳酸脫氫酶ldh基因進(jìn)行敲除，對原始菌株進(jìn)行基因改造，構(gòu)建敲除ldh基因的陰溝腸桿菌(E.cloacae△ldh)并對其生物特性進(jìn)行初步研究。通過本課題的研究，利用接合同源重組技術(shù)生產(chǎn)乙偶姻，為構(gòu)建高效、穩(wěn)定的生產(chǎn)乙偶姻工程的菌株奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。同時采用了同源重組技術(shù)，這也為利用分子手段進(jìn)行菌株改造探索了方法，為今后相關(guān)微生物發(fā)酵工程菌株的獲得及大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持和菌種保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 陰溝腸桿菌E.cloacae，大腸桿菌E.coli DH5α以及大腸桿菌E.coli S17-1 λpir均來自于黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，用于ldh左右同源臂的克隆轉(zhuǎn)化和與E.cloacae接合。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒 pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司，用于克隆載體；自殺質(zhì)粒pKR6K由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pT-ldh和pKR6K-△L均自行構(gòu)建，用于克隆ldh上下游片段和敲除ldh基因自殺質(zhì)粒。

1.1.3 酶與試劑 1.1×T3 Super PCR Mix(TSE030)購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，TranStart?FastPfu DNA polymerase(AP221-01)、2.5 mmol/L High Pure dNTPs(AD101-1)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamHI(R0136V)、EcoRI-HF(R3101V)、XbaI(R0145V)、SphI(R0182V)、SalI-HF(R3138V)、HindIII-HF(R3104V)均購自 New England Biolabs公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)、質(zhì)粒小提試劑盒（貨號DP103-02）及細(xì)菌基因組DNA（小量）提取試劑盒(DP302-02)均購自北京天根生化科技有限公司。Taq DNA polymerase、DNA Ligation Kit Ver.2.1(6022Q)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、DL2000 Marker(3427A)、DL5000 Marker(3582Q)、DL15000 Marker(3582A)購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 擴(kuò)增引物 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中E.cloacae的基因組序列信息，利用Snapgene設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所用的PCR引物，用于克隆ldh基因以及驗(yàn)證敲除結(jié)果，如表1所示。

表1 引物序列

1.1.5 培養(yǎng)基 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，酵母提取物 5，蛋白胨 10，pH 7.0，121℃高壓滅菌15 min，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉，用于本研究細(xì)菌的培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO44.4，KH2PO41.3，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，酵母浸粉1，加入蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 7.0，121℃高溫高壓滅菌15 min。將上述已滅菌的溶液加入到經(jīng)108℃高壓滅菌20 min的40 g葡萄糖中，用于陰溝腸桿菌的培養(yǎng)；加入到經(jīng)108℃高壓滅菌20 min的60 g葡萄糖中，用于陰溝腸桿菌生產(chǎn)乙偶姻的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株E.cloacae基因提取 將經(jīng)過菌株活化和復(fù)壯后的E.cloacae接種到LB液體培養(yǎng)基中，35℃，140 r/min的條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取2株菌體的基因組。

1.2.2ldh基因上下游片段的克隆與測序 用表1的引物對ldh基因上下游片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如表2和表3所示。以pMD18-T載體為連接骨架，分別將加“A”后的ldh1基因和ldh2基因PCR產(chǎn)物與其在16℃金屬浴中過夜連接，進(jìn)行“TA”克隆，將重組質(zhì)粒命名為pT-ldh1和pT-ldh2。

表2 ldh1和ldh2 PCR反應(yīng)體系組分

表3 ldh1和ldh2 PCR反應(yīng)程序

1.2.3 pKR6K-△L敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 利用內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對pT-ldh1和自殺質(zhì)粒pKR6K分別進(jìn)行雙酶切，在37℃條件下反應(yīng)120 min，將回收片段ldh1通過T4連接酶插入到線性載體pKR6K(EcoRI、BamHI)中，16℃過夜連接。在插入ldh1片段的相鄰位置，選擇內(nèi)切酶XbaI和SalI分別對pT-ldh2和插入到線性載體pKR6K-ldh1(XbaI、SalI)過程中進(jìn)行酶切處理，這樣ldh1-ldh2部分就組成了敲除ldh基因的同源重組片段，同時得到ldh基因敲除質(zhì)粒pKR6K-△L。整體構(gòu)建策略如圖1所示。

圖1 基因敲除質(zhì)粒pKR6K-△L完整構(gòu)建策略

1.2.4E.cloacae和E.cloacae△ldh菌株的生長情況的測定 出發(fā)菌株E.cloacae和重組菌株E.cloacae△ldh以1%接種量分別接種到100 mL/250 mL種子液培養(yǎng)基中35℃，140 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以1%接種量分別轉(zhuǎn)接到100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃，140 r/min發(fā)酵48 h后結(jié)束。分別在0、2、4、8、12、24、36、48 h取樣，將樣品稀釋10倍進(jìn)行其pH和OD600處的吸光值的測定。繪制菌株生長情況及發(fā)酵液的pH的變化曲線。

1.2.5E.cloacae和E.cloacae△ldh菌株的發(fā)酵產(chǎn)物及底物消耗情況檢測試驗(yàn) 將E.cloacae和E.cloacae△ldh甘油管接種到種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)(35℃，140 r/min)，在12 h后，以1%的接種量將種子培養(yǎng)基中的菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵48 h。溫度35℃，轉(zhuǎn)速140 r/min。分別在0、2、4、8、12、24、36、48 h取樣。樣品經(jīng)處理后，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測乙偶姻等相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量以及底物的剩余濃度。

1.2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS Statistics19軟件對本試驗(yàn)所有樣本重復(fù)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以X±SD表示，均數(shù)間的比較采用差異顯著性分析，ldh0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.cloacae基因組提取

原始菌株E.cloacae進(jìn)行基因組提取，對提取的樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示，在15 kb的上方有一條清晰的條帶，說明E.cloacae基因組提取成功。

圖2 E.cloacae基因組DNA

2.2 ldh基因上下游片段的克隆及測序

以上述提取的原始菌株E.cloacae基因組DNA為模板，利用引物ldh1F、ldh1R和ldh2F、ldh2R分別對目的基因ldh1和ldh2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為526 bp（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 ldh1和ldh2片段擴(kuò)增結(jié)果

將擴(kuò)增產(chǎn)物分別與克隆載體pMD18-T連接，通過熱激法轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取菌株質(zhì)粒分別進(jìn)行HindIII單酶切驗(yàn)證，以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在2500 bp和5000 bp中間有一清晰的條帶，長度大小與擴(kuò)增產(chǎn)物ldh1、ldh2(506 bp)和pMD18-T(2692 bp)之和(3218 bp)相符，證明目的基因ldh1、ldh2已連接到克隆載體（圖4）。

圖4 HindIII酶切結(jié)果

2.3 pKR6K-△L敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

以限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對質(zhì)粒pT-ldh1和pKR6K進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，酶切結(jié)果如圖5所示，質(zhì)粒pT-ldh1和pKR6K被完全酶切。通過T4連接酶連接pKR6K（EcoRI和BamHI，5199 bp）與ldh1（EcoRI和BamHI，506 bp），連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化到E.coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞中。

圖5 EcoRI和BamHI酶切結(jié)果

提取質(zhì)粒pT-ldh2和pKR6K-ldh1，以限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI對上述質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，pT-ldh2酶切結(jié)果如圖6所示，質(zhì)粒pT-ldh2和pKR6K-ldh1被完全酶切。通過T4連接酶連接pKR6K-ldh1（XbaI和SalI，5699 bp）與ldh2（XbaI和SalI，506 bp），連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化到E.coliS17-1感受態(tài)細(xì)胞中。

圖6 XbaI和SalI酶切結(jié)果

2.4 E.cloacae乳酸脫氫酶(ldh)基因缺失菌株的篩選

E.cloacae中l(wèi)dh基因單交換菌株的篩選結(jié)果如圖7所示，將發(fā)生單交換重組的E.cloacae接種于含10%蔗糖不含NaCl的LB培養(yǎng)基中35℃過夜培養(yǎng)后，涂布于含10%蔗糖不含NaCl的LB固體培養(yǎng)基上，35℃過夜培養(yǎng)，對長出的菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，利用發(fā)生重組部分的外側(cè)引物ldh-up和ldh-down進(jìn)行PCR反應(yīng)，如圖8所示，同源重組片段ldh1-ldh2已完全整合到宿主菌E.cloacae的染色體基因組上。

圖7 E.cloacae中l(wèi)dh基因單交換菌株的篩選

圖8 E.cloacae△ldh突變株篩選結(jié)果

2.5 E.cloacae與E.cloacae△ldh的生長情況

對E.cloacae和E.cloacae△ldh進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)（E.cloacae作為對照菌株），結(jié)果如圖9所示。敲除ldh基因?qū).cloacae的生長情況并無明顯影響，二者均在12 h時達(dá)到最大值，OD600值在0.85左右。兩者的pH值變化均處于下降趨勢，穩(wěn)定在5.6左右。

圖9 E.cloacae與E.cloacae△ldh的生長情況

2.6 E.cloacae與E.cloacae△ldh的發(fā)酵產(chǎn)物及底物消耗情況測定

通過HPLC測定乙偶姻、2,3-丁二醇、底物葡萄糖以及乳酸濃度，結(jié)果如圖10所示。由發(fā)酵結(jié)果顯示，出發(fā)菌株E.cloacae與重組菌株E.cloacae△ldh的葡萄糖均在12 h時基本耗盡，直至24 h消耗完全，菌株的OD600隨葡萄糖的消耗而增加，重組菌株在12 h時，2,3-丁二醇的產(chǎn)量達(dá)到最大值為18.28±0.42 g/L，此時出發(fā)菌株的2,3-丁二醇產(chǎn)量為17.11±0.51 g/L，由此可知敲除ldh基因使2,3-丁二醇的產(chǎn)量提高了6.8%，差異顯著(ldh0.05)。在原始菌株中12 h時，乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大值為2.85±0.21 g/L；重組菌株E.cloacae△ldh在24 h時丁二酸的產(chǎn)量最高為2.46±0.10 g/L，而出發(fā)菌株在48 h時丁二酸的產(chǎn)量最大，為2.08±0.24 g/L，因此丁二酸的產(chǎn)量提高了18.3%，差異顯著(ldh0.05)。

圖10 E.cloacae與E.cloacae△ldh的發(fā)酵產(chǎn)物及底物消耗情況結(jié)果

出發(fā)菌株E.cloacae與重組菌株E.cloacae△ldh各產(chǎn)物產(chǎn)量如表4所示。出發(fā)菌株E.cloacae在12 h時，乳酸產(chǎn)量最大，為2.85±0.21 g/L；E.cloacae△ldh發(fā)酵過程中2,3-丁二醇的最大產(chǎn)量為18.28±42 g/L，比E.cloacae產(chǎn)生的17.11±0.51 g/L提高了6.8%，但乙偶姻的產(chǎn)量變化不大，差異不顯著(P＞0.05)。此外，丁二酸的產(chǎn)量由原來的2.08±0.24 g/L提高到2.46±0.10 g/L，提高了18.3%，差異顯著(ldh0.05)。乙酸產(chǎn)量由2.92±0.20 g/L提高到3.63±0.29 g/L，提高了24.3%，差異顯著(ldh0.05)。乙醇的產(chǎn)量變化不大，差異不顯著(P＞0.05)。

表4 E.cloacae和E.cloacae△ldh的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物的比較

3 討論

隨著20世紀(jì)80年代提出可持續(xù)發(fā)展概念以來，人們對于環(huán)境與資源的保護(hù)意識的日益提高，乙偶姻作為一種重要的平臺化合物，其在各個領(lǐng)域均被廣泛應(yīng)用[22]。在自然界中，許多微生物的代謝產(chǎn)物中都發(fā)現(xiàn)了乙偶姻的存在。提高乙偶姻的產(chǎn)量可以從以下幾個方面進(jìn)行研究，阻止乙偶姻的進(jìn)一步代謝，阻斷其他分支代謝路徑以及加強(qiáng)乙偶姻合成的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)[23]。Zhang等[24]敲除陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SDM53中2,3-丁二醇(2,3-BD)脫氫酶基因budC，運(yùn)用分批補(bǔ)料的方法，以木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物最為底物，乙偶姻產(chǎn)量可達(dá)45.6 g/L，乙偶姻產(chǎn)量得到明顯提高。Hillman等[25]發(fā)現(xiàn)在以葡萄糖為碳源發(fā)酵時，野生型變形鏈球菌(Streptococcus mutans)與乳酸脫氫酶缺陷型突變體相比，乳酸脫氫酶缺陷型突變體的乙偶姻產(chǎn)量遠(yuǎn)高于野生型。Liu等[26]通過敲除丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因adc，使得乙偶姻得率提高了37.5%。饒志明等[27]對野生型枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JNA中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf進(jìn)行過表達(dá)，以150 g/L葡萄糖對重組菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，乙偶姻產(chǎn)量為71.4 g/L，乙偶姻產(chǎn)量相比于出發(fā)菌株提高了84%，2,3-丁二醇產(chǎn)量為2.4 g/L，相比于出發(fā)菌株下降了86%。Xu等[28]在大腸桿菌(Escherichia coli)中過量表達(dá)源于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的butB與butA基因，對重組菌株通過5 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，D-(-)-乙偶姻的最大產(chǎn)量達(dá)到60.3 g/L，產(chǎn)率為86.3%。

本試驗(yàn)以陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SDM作為出發(fā)菌株，使用自殺質(zhì)粒pKR6K構(gòu)建基因敲除載體，通過細(xì)菌接合的方式敲除載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌中進(jìn)行同源重組的基因敲除，構(gòu)建了乳酸合成途徑中乳酸脫氫酶缺失重組菌株E.cloacae△ldh。以60 g/L葡萄糖為底物，同時對E.cloacae和E.cloacae△ldh菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，利用高效液相色譜(HPLC)對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測，出發(fā)菌株乙偶姻產(chǎn)量為2.83±0.48 g/L，發(fā)現(xiàn)改造后的E.cloacae△ldh的乙偶姻產(chǎn)量為3.05±0.27 g/L，相比于出發(fā)菌株E.cloacae△ldh乙偶姻產(chǎn)量無明顯變化；E.cloacae乙偶姻的轉(zhuǎn)化率(0.05±0.01 g/g)與生產(chǎn)強(qiáng)度(0.06±0.01 g/L·h)和E.cloacae△ldh乙偶姻的轉(zhuǎn)化率(0.05±0.01 g/g)與生產(chǎn)強(qiáng)度(0.06±0.01 g/L·h)相比并沒有變化。敲除ldh基因雖然沒有對乙偶姻產(chǎn)量造成顯著影響，但丁二酸的產(chǎn)量提高18.3%，2,3-丁二醇也有小幅度的提升，這說明敲除ldh基因雖然沒有使乙偶姻的產(chǎn)量提高，但由于阻斷了乳酸代謝途徑，也使碳源流向了其他的代謝路徑。重組菌株E.cloacae△ldh中幾乎沒有檢測到乳酸的產(chǎn)生，進(jìn)一步說明ldh基因成功敲除，使重組菌株不產(chǎn)生乳酸。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)為探索敲除陰溝腸桿菌(E.cloacae)中l(wèi)dh基因?qū)σ遗家鲂纬陕窂街泻康牡挠绊?，以?shí)驗(yàn)室保藏的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SDM作為出發(fā)菌株構(gòu)建E.cloacae△ldh，得到結(jié)論如下：成功克隆出兩段E.cloacae乳酸脫氫酶基因的同源序列，長度分別為526 bp，通過序列比對分析，E.cloacae乳酸脫氫酶基因序列相似性為100%。通過對E.cloacae進(jìn)行乳酸脫氫酶基因的敲除，成功構(gòu)建一株ldh缺失重組菌株E.cloacae△ldh，乙偶姻產(chǎn)量雖無明顯變化，但發(fā)酵液中并沒有檢測到乳酸，同時2,3-丁二醇提高6.8%，乙酸提高了24.3%。