李榮田，于曉晨，孔夢瑩，劉長華,3

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

水稻(Oryza sativa)，是中國及世界重要的糧食作物[1]。螟蟲特別是二化螟和三化螟的危害造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)，危害最大的二化螟在中國南北稻區(qū)都有分布[2]。黑龍江省是中國最大的粳稻產(chǎn)區(qū)，自1998年在五常市稻田首次發(fā)現(xiàn)二化螟以來，螟蟲危害快速蔓延，逐年加重。中國每年投入大量人力、財(cái)力進(jìn)行藥劑防治水稻蟲害，但蟲害造成的損失仍然十分嚴(yán)重[3-4]。培育抗蟲水稻品種是防治蟲害最經(jīng)濟(jì)有效的措施[5-6]。由于水稻及其近緣種缺乏抗螟蟲基因，利用傳統(tǒng)雜交方法難以培育出抗蟲品種。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗螟蟲基因?qū)胨局?，為培育高抗螟蟲水稻提供了新思路[7-8]。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是革蘭氏陽性菌，可以形成Bt殺蟲晶體蛋白，對鱗翅目害蟲有很高的、專一的殺蟲性，且不會對人類產(chǎn)生毒害[9-10]。cry2A是編碼Bt蛋白質(zhì)的基因之一，以cry2Aa基因?yàn)樗{(lán)本，在其編碼蛋白質(zhì)氨基酸順序不變的條件下，根據(jù)水稻密碼子偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化并人工合成了cry2A*基因。轉(zhuǎn)cry2A*基因秈稻表現(xiàn)出穩(wěn)定的、較好的抗螟蟲性[11]。水稻‘空育131’是北方粳稻及黑龍江省歷史上年種植面積最大的常規(guī)品種，利用根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法，將cry2A*基因?qū)胨尽沼?31’中，創(chuàng)制了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻‘HD2-1’等獨(dú)立系。Bt植物的抗蟲能力強(qiáng)弱與Bt蛋白含量(Bt Protein Content,BPC)有關(guān)。Bt水稻生長發(fā)育過程中外源目的基因表達(dá)是動態(tài)變化的，白耀宇等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葉片及莖鞘BPC抽穗期較低，灌漿期顯著升高；華樺[13]認(rèn)為，葉片及莖鞘BPC孕穗期最高，然后逐漸降低；陳耕[14]報(bào)道，葉片BPC成熟期最高，莖鞘BPC分蘗期最高；于志晶等[15-16]認(rèn)為，分蘗期、抽穗期以及灌漿期的葉片BPC差異并不大。不同研究關(guān)于Bt水稻外源目的基因表達(dá)量動態(tài)變化過程的研究結(jié)論存在著差異，其原因可能在于轉(zhuǎn)基因Bt水稻材料及生長發(fā)育環(huán)境不同，外源基因表達(dá)能力不同，因此研究轉(zhuǎn)cry2A*基因抗蟲水稻‘HD2-1’等獨(dú)立系在黑龍江省田間不同生長發(fā)育階段目的基因的表達(dá)量是十分必要的。本研究將水稻‘HD2-1’等獨(dú)立系種植在田間，分別于分蘗期、抽穗期及灌漿期檢測有關(guān)器官cry2A*基因表達(dá)量以及糙米BPC，分析不同生長發(fā)育階段外源目的基因表達(dá)量的關(guān)系，以期為培育及利用寒區(qū)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 水稻

水稻材料為‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨(dú)立系。以早粳稻‘空育131’為受體，利用根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法創(chuàng)制轉(zhuǎn)Bt基因cry2A*早粳稻。攜帶cry2A*基因Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)見圖1。遺傳轉(zhuǎn)化水稻以獨(dú)立抗性愈傷組織系（下稱獨(dú)立系）為單位，在溫室內(nèi)以生長發(fā)育正常、外源基因bar和cry2A*等PCR檢測陽性、抗除草劑Basta、Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測陽性、室內(nèi)高抗二化螟等為指標(biāo)，每個獨(dú)立系每個世代選擇1株，直至穩(wěn)定世代形成水稻‘HD2’，即為攜帶外源基因bar和cry2A*的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻?！瓾D2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等是來自于不同獨(dú)立系的水稻‘HD2’。

圖1 植物表達(dá)載體pbar-cry2A*的T-DNA區(qū)

受體水稻‘空育131’作對照。

1.2 Basta抗感性檢測

培育供試水稻秧苗，秧苗3葉1心期用Basta處理。Basta即除草劑草丁膦或草銨膦，有效成分是膦絲菌素。將含膦絲菌素0.5%的Basta工作液均勻地噴施在供試水稻葉片上，連續(xù)7天觀察水稻植株的變化并記錄其抗感Basta情況[17]。

1.3 PCR檢測

水稻‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨(dú)立系抗Basta的秧苗及對照‘空育131’的秧苗，每個供試水稻隨機(jī)取5株，每株取1片嫩葉，用CTAB方法[18]提取DNA。對水稻DNA樣品分別進(jìn)行actin基因（內(nèi)參基因）、bar基因及cry2A*基因的PCR檢測。PCR所需的引物序列及預(yù)期產(chǎn)物大小如表1所示。

PCR反應(yīng)體系：水稻模板DNA 1.5 μL，actin、bar或cry2A*正向引物 0.5 μL(10 μmol/L)，actin、bar或cry2A*反向引物0.5 μL(10 μmol/L)，2 ×TaqPCR Master Mix 5.15 μL，ddH2O 12.35 μL，總體積為20 μL。

PCR 擴(kuò) 增程序(actin)：94℃，3 min；94℃ 變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35循環(huán)；72℃，8 min；4℃儲存。

PCR擴(kuò)增程序（bar或cry2A*）：94℃，3 min；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，32循環(huán)；72℃，8 min；4℃儲存。

PCR完成后，在產(chǎn)物中加2 μL 6×loading buffer，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)條帶的有無。

1.4 Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測

供檢測的水稻樣品同1.3。利用武漢上成生物科技有限公司的Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測水稻‘HD2’cry2A*基因是否表達(dá)Bt蛋白，操作步驟按膠體金免疫層析試紙條使用說明書進(jìn)行。

1.5 本田試驗(yàn)設(shè)計(jì)及cry2A*基因表達(dá)量檢測

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2020年正季，在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)轉(zhuǎn)基因水稻試驗(yàn)田(126°38'25.25"E,45°59'47.70"N)種植水稻‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨(dú)立系及對照‘空育131’。本田田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用隨機(jī)區(qū)組法，3次重復(fù)。小區(qū)6行區(qū)，行長5 m，插秧規(guī)格為行距30 cm，株距12 cm，每蔸插1棵秧苗，小區(qū)面積為9 m2。育苗、插秧、施肥、水管理、防病等與一般生產(chǎn)田相同，不進(jìn)行二化螟等蟲害防治。在水稻分蘗期、抽穗期和灌漿期，從田間每小區(qū)隨機(jī)選取3蔸水稻，取每蔸主莖，將主莖分為最上部完全展開葉葉片、莖鞘及幼穗等3個器官，每個器官分別準(zhǔn)確取100 mg及大約取20 mg左右2份，用滅菌的錫箔紙包好置液氮中保存，用于檢測cry2A*基因的mRNA表達(dá)量及BPC。收獲期田間每小區(qū)收獲稻谷，室內(nèi)充分干燥后加工成糙米，從各小區(qū)糙米中取出3份20 mg左右的樣品用于檢測糙米BPC。

1.5.2 mRNA表達(dá)量檢測 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測供試水稻cry2A*基因mRNA表達(dá)量[19]。操作步驟如下。

（1）總RNA的提取：利用生工生物工程（上海）股份有限公司的UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，按照說明書提取水稻樣品總RNA，檢測總RNA的純度及完整性并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：用生工生物工程（上海）股份有限公司的M-MuLV第1鏈cDNA合成試劑盒，依據(jù)其說明書對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

（3）qRT-PCR：使用TaKaRa TB Green?Premix Ex Taq?II試劑盒，利用Bio-Rad iQTM2多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行cry2A*基因的qRT-PCR檢測。qRT-PCR內(nèi)參基因actin的正向引物為5‘TCGTGTAGCACCAGAAGAGCA3’，反向引物為5‘TCCACTAGCATAGAGGGAAAGC3’；cry2A*目的基因的正向引物是5‘TTCCTGCTGAAGAAGGTGGGT3’，反向引物是 5‘ACGAGCGAGGGTGTCAGTGTT3’。qRT-PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR 反應(yīng)體系20 μL，水稻cDNA 2 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL，actin或cry2A*基因正向引物(10 μmol/L)0.8 μL，actin或cry2A*基因反向引物(10 μmol/L)0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR 擴(kuò)增程序：95℃，3 min；(95℃，10 s；57℃，30 s)，40個循環(huán)，實(shí)時(shí)采集熒光強(qiáng)度信號；95℃，1 min；57℃，1 min；57℃，10 s（溫度變化范圍 57～95℃），77個循環(huán)，自第2個循環(huán)開始每個循環(huán)上升0.5℃，實(shí)時(shí)采集熒光強(qiáng)度信號并形成溶解曲線。

（4）cry2A*基因mRNA表達(dá)量：以內(nèi)參基因actin為標(biāo)準(zhǔn)，以水稻‘空育131’為對照，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)量[20]。

1.5.3 Cry2A蛋白含量檢測 利用武漢上成生物科技有限公司“轉(zhuǎn)基因Bt Cry2A酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒”檢測水稻樣品cry2A*基因BPC，具體步驟見參考李榮田等[21]的研究方法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個小區(qū)不同生長發(fā)育階段各器官的3個水稻樣品為3次技術(shù)重復(fù)，cry2A*基因mRNA表達(dá)量及BPC 3次技術(shù)重復(fù)間差異不得大于5%，3次技術(shù)重復(fù)的平均值為小區(qū)值，以小區(qū)值進(jìn)行差異顯著性檢測及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻‘HD2’外源基因的整合及表達(dá)

Basta抗感性檢測、PCR檢測及Cry2A膠體金免疫層析試紙條檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，在‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨(dú)立系各植株中都整合了bar及cry2A*基因，并且耐除草劑Basta及Cry2A蛋白陽性。說明水稻‘HD2’等獨(dú)立系攜帶bar和cry2A*等外源基因，并且外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻‘HD2’外源基因的整合及表達(dá)

2.2 水稻‘HD2’cry2A*基因表達(dá)量

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發(fā)育階段目的基因cry2A*的mRNA表達(dá)量見表2。由表2可知，在葉片和莖鞘中‘HD2’水稻cry2A*基因mRNA表達(dá)量生長發(fā)育前期相對較低，后期相對較高；幼穗中生長發(fā)育前期較高，后期較低。水稻分蘗期、抽穗期、灌漿期的各器官mRNA表達(dá)量在‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’之間存在著顯著或極顯著差異。

表2 水稻‘HD2’cry2A*基因mRNA表達(dá)量

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發(fā)育階段各器官Cry2A蛋白含量見表3。由表3可知，‘HD2’水稻成熟期糙米中的Cry2A蛋白含量與生長發(fā)育過程組織器官BPC比較是最低的；在葉片、莖鞘中，Cry2A蛋白含量最高的生長發(fā)育時(shí)期為灌漿期，其次為抽穗期、分蘗期；在幼穗中，Cry2A蛋白含量最高的生長發(fā)育時(shí)期是抽穗期，其次是灌漿期。水稻分蘗期、抽穗期、灌漿期各器官及糙米的BPC在‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等獨(dú)立系間存在著極顯著差異。

表3 水稻‘HD2’Cry2A蛋白含量

2.3 水稻‘HD2’cry2A*基因表達(dá)量不同生長發(fā)育階段間的關(guān)系

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻‘HD2’不同生長發(fā)育階段cry2A*基因表達(dá)量關(guān)系見圖3。圖3A顯示，‘HD2’水稻cry2A*基因mRNA表達(dá)量，在葉片中，分蘗期與抽穗期、抽穗期與灌漿期及分蘗期與灌漿期之間呈顯著正相關(guān)；在莖鞘中，分蘗期與灌漿期之間呈顯著正相關(guān)，分蘗期與抽穗期、抽穗期與灌漿期之間呈正相關(guān)趨勢；在幼穗中，抽穗期與灌漿期呈顯著正相關(guān)。說明，轉(zhuǎn)cry2A*基因抗蟲水稻‘HD2’組織器官的cry2A*基因mRNA表達(dá)量在不同生長發(fā)育階段間具有正向關(guān)系，前期目的基因mRNA表達(dá)量高，后期往往也高。

圖3 水稻‘HD2’cry2A*基因表達(dá)量在不同生長發(fā)育階段間的關(guān)系

圖3B顯示，‘HD2’水稻Cry2A蛋白含量在葉片中，分蘗期與抽穗期呈顯著正相關(guān)，抽穗期與灌漿期及分蘗期與灌漿期之間有正相關(guān)趨勢；在莖鞘中，分蘗期與抽穗期、抽穗期與灌漿期之間呈顯著正相關(guān)，分蘗期與灌漿期之間呈正相關(guān)趨勢；在幼穗中，抽穗期與灌漿期呈顯著正相關(guān)。這表明，轉(zhuǎn)cry2A*基因抗蟲水稻組織器官中BPC在不同生長發(fā)育階段具有正相關(guān)關(guān)系，前期Bt含量高，后期含量往往也高。

2.4 水稻‘HD2’cry2A*基因mRNA表達(dá)量和BPC的關(guān)系

水稻‘HD2’各器官不同生長發(fā)育階段cry2A*基因mRNA表達(dá)量和BPC的關(guān)系見圖4。圖4顯示，在葉片、莖鞘及幼穗等器官中，cry2A*基因mRNA表達(dá)量和BPC均呈極顯著的正向直線關(guān)系。這說明，在轉(zhuǎn)cry2A*基因抗蟲水稻整個田間生長發(fā)育時(shí)期，器官組織中目的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量高，翻譯水平表達(dá)量通常也高。同時(shí)，暗示著水稻‘HD2’cry2A*基因mRNA及其蛋白質(zhì)在水稻細(xì)胞中具有穩(wěn)定性。

圖4 水稻‘HD2’生長發(fā)育過程cry2A*基因mRNA表達(dá)量和BPC的關(guān)系

2.5 水稻‘HD2’糙米BPC與cry2A*基因表達(dá)量的關(guān)系

水稻‘HD2’糙米BPC與不同生長發(fā)育階段各器官cry2A*基因表達(dá)量的關(guān)系見圖5。圖5A顯示，水稻‘HD2’糙米BPC與分蘗期葉片和莖鞘、抽穗期幼穗及灌漿期葉片cry2A*基因mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，與灌漿期莖鞘和幼穗cry2A*基因mRNA表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)，與抽穗期葉片和莖鞘的cry2A*基因mRNA表達(dá)量有正相關(guān)趨勢。這表明，轉(zhuǎn)cry2A*基因抗蟲水稻糙米BPC和生長發(fā)育過程中的組織器官里的目的基因轉(zhuǎn)錄水平具有正相關(guān)關(guān)系，特別是與生長發(fā)育中后期的幼穗目的基因轉(zhuǎn)錄水平的正相關(guān)關(guān)系更緊密。

圖5 水稻‘HD2’糙米BPC與不同生長發(fā)育階段cry2A*基因表達(dá)量的關(guān)系

由圖5B可知，水稻‘HD2’糙米BPC與分蘗期及抽穗期的葉片Cry2A蛋白含量呈正相關(guān)趨勢，與分蘗期的莖鞘、抽穗期的莖鞘和幼穗及灌漿期的葉片、莖鞘和幼穗Cry2A蛋白含量呈顯著或極顯著的正相關(guān)。這說明，轉(zhuǎn)cry2A*基因抗蟲水稻‘HD2’糙米BPC與生長發(fā)育過程中的組織器官的BPC具有正相關(guān)關(guān)系，特別是與生長發(fā)育中后期的目的基因翻譯水平表達(dá)量正相關(guān)關(guān)系更明顯。

3 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻‘HD2-1’、‘HD2-2’、‘HD2-3’和‘HD2-4’等不同的獨(dú)立系，田間不同生長發(fā)育階段各器官cry2A*基因mRNA表達(dá)量及其蛋白質(zhì)含量明顯不同，糙米BPC也存在著明顯差異。葉片、莖鞘及幼穗等器官cry2A*基因表達(dá)量在不同生長發(fā)育階段間具有正相關(guān)或正相關(guān)趨勢，前期表達(dá)量高的材料往往后期表達(dá)量也高。

水稻‘HD2’田間生長發(fā)育期間組織器官cry2A*基因mRNA表達(dá)量和BPC呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，目的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量高，翻譯水平表達(dá)量也高。

水稻‘HD2’糙米BPC與田間生長發(fā)育時(shí)期的葉片、莖鞘及幼穗等器官cry2A*基因mRNA表達(dá)量、BPC具有正相關(guān)或正相關(guān)趨勢，田間生長發(fā)育時(shí)外源目的基因表達(dá)量高，糙米BPC往往也高。

4 討論

關(guān)于Bt植物目的基因表達(dá)量不同生長發(fā)育階段間的關(guān)系，轉(zhuǎn)基因楊樹葉片Bt基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達(dá)量在前期和后期間均存在正相關(guān)[22]，Bt棉主莖功能葉BPC在不同生長階段間未見正相關(guān)關(guān)系[23]。本研究顯示，轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻‘HD2-1’等獨(dú)立系葉片、莖鞘及幼穗cry2A*基因mRNA表達(dá)量和BPC在不同生長發(fā)育階段間存在正相關(guān)關(guān)系。關(guān)于Bt植物目的基因mRNA表達(dá)量和BPC的關(guān)系，夏蘭芹等報(bào)道，Bt棉目的基因mRNA和Bt殺蟲蛋白含量存在正相關(guān)趨勢，但未達(dá)顯著水平[24]。孫玥研究不同受體品種的轉(zhuǎn)Bt基因水稻抽穗期葉片、莖稈及穎殼中Bt基因mRNA表達(dá)量與BPC間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了與Bt棉類似的現(xiàn)象，即目的基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達(dá)量存在著正相關(guān)趨勢[25]。但是，本研究結(jié)果表明，水稻‘HD2-1’等獨(dú)立系生長發(fā)育過程中組織器官中Bt基因mRNA表達(dá)量和BPC呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。本研究的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻獨(dú)立系是同一個受體品種、具有相同的外源基因卡盒、來自于不同的轉(zhuǎn)化事件，最大程度地排除了基因表達(dá)框架和遺傳背景差異的影響，研究結(jié)果可能更符合客觀情況。種植在田間的、同一受體品種及T-DNA區(qū)的不同的轉(zhuǎn)基因水稻，外源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯水平生長發(fā)育前期表達(dá)量高、中后期往往也高，生長發(fā)育過程中目的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量高、翻譯水平表達(dá)量也高。

Bt水稻目的基因蛋白含量與田間抗蟲性呈正相關(guān)，BPC太低的轉(zhuǎn)基因水稻沒有抗蟲性[26]，當(dāng)BPC超過一定閾值時(shí)，植株田間均表現(xiàn)為高抗蟲性[21]。本研究中的水稻材料經(jīng)過了抗二化螟選擇，雖然不同材料cry2A*基因表達(dá)量不同，但是是在較高表達(dá)量范疇的差異。糙米是水稻重要的經(jīng)濟(jì)器官，本研究顯示轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻糙米BPC和田間生長發(fā)育時(shí)外源目的基因表達(dá)量存在正相關(guān)。從稻米消費(fèi)者的心理角度出發(fā)，在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品種工作中，需要注意“高中選低”，即從外源目的基因表達(dá)量較高的抗蟲材料中選擇表達(dá)量較低的基因型。