趙曉萌，袁肇方，孫雨琪，楊 琨,2*

1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030

牦牛是主要生活在喜馬拉雅山脈和青藏高原的哺乳動(dòng)物，其生理機(jī)能和形態(tài)結(jié)構(gòu)與當(dāng)?shù)丨h(huán)境形成了良好的適應(yīng)性，是研究低氧適應(yīng)性的良好材料[1]。

白介素細(xì)胞-4（白介素-4, Interleukin-4, IL-4）為趨化因子家族的一員，是由活化的T淋巴細(xì)胞、Th2和肥大細(xì)胞等產(chǎn)生，是II型輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子[2]。IL4能夠與IL-4受體相結(jié)合來(lái)激活免疫細(xì)胞，使T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行增殖，從而在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

鑒于白介素-4基因的重要生物學(xué)功能,且目前還尚未見到對(duì)牦牛白介素-4基因的生物信息學(xué)報(bào)道。本研究全面深入地對(duì)牦牛IL-4的生物信息進(jìn)行分析,旨在為研究IL-4基因的高原低氧適應(yīng)性生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)找到10個(gè)物種與牦牛IL-4基因（登錄號(hào)：XM_005888362.1），如下表1。

表1 不同物種IL-4基因的序列來(lái)源

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

使用ProtParam、ProtScale和SignalP-4.1對(duì)牦牛IL-4基因的理化性質(zhì)、疏水性與親水性、信號(hào)肽進(jìn)行分析。然后通過(guò)Netphos3.1Server、Yloc、TMpred軟件對(duì)IL-4基因的磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)Sopma與SWISS MODERL軟件分別預(yù)測(cè)IL-4基因的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用NCBI-BLAST、KEGG和STRING分析牦牛IL-4的同源性相似度、信號(hào)通路和蛋白預(yù)測(cè)互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛IL-4基因的開放閱讀框分析

IL-4基因的總?cè)L(zhǎng)為571 bp，其中CDS區(qū)的范圍為67～474 bp。結(jié)果分析表明IL-4基因包含ORF1-ORF2兩個(gè)子ORF，它們的核苷酸起止位點(diǎn)及片段大小均不同，大小分別為135 bp和277 bp。

2.2 牦牛IL-4基因的理化性質(zhì)分析

牦牛IL-4基因共編碼135個(gè)氨基酸，其中Leu占14.1%，Thr占11.1%。蛋 白 質(zhì) 分 子 量為15 118.84，理論等電點(diǎn)為9.20，分子式為C661H1107N185O195S11，共2 159個(gè)原子，脂肪指數(shù)為99.63，負(fù)電荷殘基總數(shù)有12個(gè),正電荷殘基總數(shù)有20個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)為46.03,屬不穩(wěn)定蛋白。氨基酸總平均親水性為-0.025，是親水性蛋白。

2.3 牦牛IL-4基因的信號(hào)肽及跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

牦牛IL-4蛋白存在信號(hào)肽，整個(gè)序列都存在于細(xì)胞膜內(nèi)，為一種跨膜蛋白，此外牦牛IL-4蛋白還存在一個(gè)強(qiáng)的跨膜螺旋區(qū)間，具體為1～22。

2.4 牦牛IL-4基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

牦牛IL-4蛋白共有67個(gè)磷酸化位，其中含44個(gè)Ser，19個(gè)Thr，7個(gè)Tyr。

2.5 牦牛IL-4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測(cè)

本次預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛IL-4蛋白α-螺旋為60.74%，β–轉(zhuǎn)角為2.22%，隨機(jī)卷曲為31.85%、延伸鏈為5.19%，可推測(cè)出在牦牛IL-4中二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和隨機(jī)卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)單元為主。

2.6 牦牛IL-4基因同源性分析

牦牛IL-4基因與黃牛、綿羊、山羊、鼠、長(zhǎng)頸鹿、獼猴、人、白鯨、寬尾海豚的同源相似性分別為99.47%、96.81%、94.76%、80.48%、93.38%、76.50%、82.56%、89.14%和88.60%，與黃牛的同源性最近，與獼猴最遠(yuǎn)。

2.7 IL-4信號(hào)通路和蛋白互作通路分析

IL-4主要參與12種信號(hào)通路，網(wǎng)絡(luò)中蛋白彼此之間的相關(guān)性緊密，且多數(shù)蛋白質(zhì)以IL-4作為媒介對(duì)彼此進(jìn)行相互作用。

3 討論

IL-4是來(lái)源于T細(xì)胞的一種細(xì)胞因子,其受體對(duì)IL4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，在IL-4R蛋白中酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化能夠促進(jìn)IL-4發(fā)揮作用，如IL-4能激活STAT6酪氨酸發(fā)生磷酸化,與特異性DNA的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合, 從而使IL-4發(fā)生轉(zhuǎn)錄。此外，通過(guò)蛋白互作分析顯示IL-4在信號(hào)通路中起到關(guān)鍵性作用，且IL-4與IL2GR、IL13RA1、JAK等蛋白關(guān)系密切，通過(guò)彼此之間的相互作用來(lái)參與物質(zhì)信號(hào)傳遞、能量代謝及細(xì)胞生命周期調(diào)控等各個(gè)環(huán)節(jié)。據(jù)研究表明IL-4通常以JAK-STAT，Ras-ERK，PI3K-pKR這3種信號(hào)傳遞發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[3]，且TCR對(duì)突變的IL-4Ra的功能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，能夠誘導(dǎo)出IL-4依賴的STAT6的活化。IL-4還能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答，參與體內(nèi)寄生蟲的清除與黏液分泌，激活嗜酸性粒細(xì)胞或其他細(xì)胞發(fā)生超敏反應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)，影響腫瘤周圍炎性細(xì)胞分化等功能。

不同物種之間IL-4基因編碼的氨基酸序列高度相似，牦牛IL-4基因與黃牛的同源性最近,與獼猴的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),表明牦牛和黃牛的IL-4蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

牦牛IL-4基因長(zhǎng)度為571 bp，共編碼135個(gè)氨基酸，其基因編碼的產(chǎn)物呈親水性，存在信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和隨機(jī)卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)單元為主，與黃牛的親源性最近。