李冰晶，羅麗平，趙景芳，王代波，劉國(guó)華，文光琴

(1貴州省生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009；2貴州省植物園，貴州 貴陽(yáng) 550009)

藍(lán)莓(Vacciniumuliginosum)，又稱越桔或藍(lán)漿果，屬杜鵑花科越桔屬落葉灌木植物，藍(lán)莓中含有非常豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為“漿果之王”[1]，果實(shí)中含有豐富的維生素、膳食纖維、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，其中藍(lán)莓中花青素含量較高。藍(lán)莓果實(shí)中含有的活性物質(zhì)具有抗衰老、緩解視疲勞、改善記憶力、抗氧化、抗癌癥等功效[2]。

藍(lán)莓中含有多種活性物質(zhì)，花青素為其中含量較高的一種[3]。為了更好地研究藍(lán)莓粗提物中成分，利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)藍(lán)莓提取物進(jìn)行分析[4-10]，通過(guò)單因素分析法，考察流動(dòng)相組成、流速、柱溫、進(jìn)樣量和時(shí)間梯度等對(duì)藍(lán)莓粗提物分離的影響，從而確定出HPLC測(cè)定藍(lán)莓粗提物的最佳條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

藍(lán)莓，由麻江羊蓋藍(lán)莓基地提供；乙醇(食品級(jí))；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；乙酸(分析純)；蒸餾水；AB-8型大孔樹脂，購(gòu)于上海藍(lán)季。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent1260高效液相色譜；BUCHI R114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DZF-6021真空干燥箱；722S型可見光分光光度計(jì)；GTR16-2型離心機(jī)；DKS-28型電熱恒溫水浴鍋；電子天平A2004；PHSJ-4A型PH計(jì)；DW-4OL262型醫(yī)用低溫保存箱；BCD-206SM型海爾冰箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將新鮮藍(lán)莓稱重置于燒瓶中，加入75 %的乙醇密封避光浸泡15 d。過(guò)濾，濃縮提取液，用大孔樹脂對(duì)濃縮液進(jìn)行初步分離，得到水洗脫的蒸餾水流份和乙醇洗脫的藍(lán)莓提取物流份，濃縮藍(lán)莓提取物流份，得到藍(lán)莓粗提物。

2.2 HPLC色譜條件考察

影響高效液相色譜分離藍(lán)莓粗提物的條件有柱選擇、流動(dòng)相、流速、柱溫、時(shí)間梯度和進(jìn)樣量等，本試驗(yàn)通過(guò)單因素分析法考察流動(dòng)相、流速、柱溫、進(jìn)樣量和梯度洗脫條件五個(gè)方面，從中選擇出最佳的測(cè)試條件進(jìn)行藍(lán)莓粗提物液相色譜測(cè)定[11-17]。

2.3 波長(zhǎng)及流動(dòng)相篩選

以藍(lán)莓粗提物作為考察對(duì)象，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描，得出目標(biāo)產(chǎn)物在529 nm處有最大吸收，因此以529 nm波長(zhǎng)最為主要波長(zhǎng)。

常用的HPLC流動(dòng)相有：水、磷酸水、甲醇、乙醇、乙腈等，以Agilent C18柱為色譜柱，分別以水-甲醇、乙酸-甲醇、磷酸水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-乙腈、乙腈-乙酸為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，考察色譜峰的分離效果，選出最佳流動(dòng)相。

2.4 流速篩選

高效液相色譜流速的改變會(huì)影響圖譜的出峰時(shí)間和峰形，本試驗(yàn)通過(guò)比較在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min三個(gè)流速下藍(lán)莓花青素的分離情況，比較各組流速的HPLC圖譜，根據(jù)圖譜選擇出能分離藍(lán)莓花青素的HPLC流速。

2.5 柱溫篩選

溫度會(huì)影響溶劑的密度、粘度等物理性質(zhì)，所以高效液相色譜柱溫的改變會(huì)對(duì)譜圖中峰的分離效果、峰形及出峰時(shí)間產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)20 ℃、25 ℃、30 ℃三個(gè)柱溫下藍(lán)莓粗提物的HPLC圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)圖譜篩選出能最好分離藍(lán)莓粗提物的HPLC柱溫。

2.6 進(jìn)樣量篩選

高效液相色譜的進(jìn)樣量不同，會(huì)對(duì)樣品的峰形和峰面積產(chǎn)生較大影響，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)5 μL、10 μL、20 μL 三個(gè)體積進(jìn)行考察，對(duì)HPLC圖譜進(jìn)行比較，篩選出能最好分離藍(lán)莓粗提物的HPLC進(jìn)樣量。

2.7 梯度洗脫條件篩選

高效液相色譜的梯度洗脫條件不同，會(huì)影響其樣品出峰時(shí)間和分離程度，本試驗(yàn)對(duì)洗脫時(shí)間和梯度的調(diào)整，對(duì)HPLC圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)圖譜篩選出能最好分離藍(lán)莓粗提物的HPLC梯度洗脫條件。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 流動(dòng)相考察結(jié)果

通過(guò)對(duì)水-甲醇、水-乙腈、0.3%磷酸-甲醇、0.3%磷酸-乙腈、0.5%乙酸-甲醇、0.5%乙酸-乙腈這6種流動(dòng)相的考察，得出分離效果最好的圖譜，見圖1。通過(guò)分析比較圖譜，當(dāng)以0.3%磷酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)分離效果明顯優(yōu)于其他流動(dòng)相條件下的分離效果。因此最終確定了乙腈(A)-0.3%磷酸(B)為花青素HPLC實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。

圖1 流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%磷酸(B)液相圖譜Fig.1 Chromatogram with mobile phase of acetonitrile(A)and0.3% phosphoric acid (B)

3.2 流速考察結(jié)果

通過(guò)對(duì)0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min三個(gè)流速的比較，得出圖2-圖4，從圖中可以看出，流速對(duì)花青素的峰分離效果和保留時(shí)間沒有太大影響，但是流速過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致基線不穩(wěn)，流速過(guò)慢，會(huì)拉長(zhǎng)分離時(shí)間，加大能耗。綜合考慮，選擇1 mL/min作為花青素HPLC實(shí)驗(yàn)流速。

圖2 流速0.8 mL/min液相圖譜Fig.2 Chromatogram with flow rate of 0.8 mL/min

圖3 流速1 mL/min液相圖譜Fig.3 Chromatogram with flow rate of 1 mL/min

圖4 流速1.5 mL/min液相圖譜Fig.4 Chromatogram with flow rate of 1.5 mL/min

3.3 柱溫篩選結(jié)果

經(jīng)對(duì)20 ℃、25 ℃、30 ℃3個(gè)柱溫進(jìn)行考察，得出圖5-圖7。從圖中可看出，隨著柱溫的升高，峰的分離效果和保留時(shí)間基本沒有變化，但是峰形逐漸變得更完整，因此選擇30 ℃為花青素HPLC法測(cè)定的柱溫。

圖5 柱溫20℃液相圖譜Fig.5 Chromatogram with column temperature of 20 ℃

圖6 柱溫25℃液相圖譜Fig.6 Chromatogram with column temperature of 25℃

圖7 柱溫30℃液相圖譜Fig.7 Chromatogram with column temperature of 30℃

3.4 進(jìn)樣量篩選結(jié)果

根據(jù)藍(lán)莓粗提物的濃度，本試驗(yàn)對(duì)5 μL、10 μL、20 μL 3個(gè)進(jìn)樣量進(jìn)行考察，如圖8-圖10所示： 5 μL時(shí)響應(yīng)值較低，約為10 mAU；而20 μL時(shí)響應(yīng)值較高，約為180 mAU；應(yīng)選擇峰值在100 mAU較為合適，故選擇10 μL作為進(jìn)樣量。

圖8 進(jìn)樣量5 μL液相圖譜Fig.8 Chromatogram with injection volume of 5 μL

圖9 進(jìn)樣量10 μL液相圖譜Fig.9 Chromatogram with injection volume of 10 μL

圖10 進(jìn)樣量20 μL液相圖譜Fig.10 Chromatogram with injection volume of 20 μL

3.5 梯度洗脫條件篩選結(jié)果

先選擇0～100 min，A：0%～30%，B：100%～70%，觀察出峰情況和保留時(shí)間。從圖11可知前10 min出峰為溶劑峰，10～50 min出峰多且密集，后40 min基本不出峰。將時(shí)間調(diào)整為0-50-70 min，A：5%-15%-30%，B：95%-85%-70%，觀察出峰情況和保留時(shí)間，從圖12可知，40～70 min出峰多且密集。將時(shí)間調(diào)整為0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%，觀察出峰情況和保留時(shí)間，從圖13可知，出峰基本分開，峰形較好。綜上所述，選擇時(shí)間：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%為花青素HPLC梯度洗脫條件。

圖11 洗脫梯度為0-100 min，A：0%-30%，B：100%-70%液相圖譜Fig.11 Chromatogram with gradient elution program of0-100 min，A：0 %-30 %，B：100 %-70 %

圖12 洗脫梯度為0-50-70 min，A：5%-15%-30%，B：95%-85%-70%液相圖譜Fig.12 Chromatogram with gradient elution program of0-50-70 min，A：5 %-15 %-30 %，B：95 %-85 %-70 %

圖13 洗脫梯度為0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%液相圖譜Fig.13 Chromatogram with gradient elution program of0-50-70-100 min，A：8 %-10 %-15 %-30 %，B：92 %-90 %-85 %-70 %

4 結(jié)論與分析

本試驗(yàn)考察了在用HPLC的測(cè)定藍(lán)莓粗提物時(shí)影響其分離和保留時(shí)間的5個(gè)因素(流動(dòng)相、流速、柱溫、進(jìn)樣量和梯度洗脫條件)，通過(guò)單因素分析法，逐一控制影響因素，根據(jù)所得圖譜逐一分析出用HPLC的測(cè)定藍(lán)莓粗提物最佳測(cè)試條件。由于所探究的目標(biāo)產(chǎn)物在529 nm處有最大吸收，因此以529 nm波長(zhǎng)最為主要波長(zhǎng)。在流動(dòng)相選擇時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相為：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)藍(lán)莓粗提物分離最好。流速和柱溫對(duì)圖譜的出峰和保留時(shí)間影響都較小，但是流速越快，會(huì)導(dǎo)致基線不穩(wěn)，而流速越慢，溫度越高峰形越趨于完美。但也不宜速度過(guò)慢和柱溫過(guò)高，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃時(shí)，效果最好。進(jìn)樣量對(duì)峰面積影響較大，應(yīng)選擇峰值在100 mAU較為合適，所以選擇10 μL作為進(jìn)樣量。根據(jù)時(shí)間和濃度確定梯度洗脫條件，經(jīng)過(guò)調(diào)整時(shí)間和濃度，最終確定梯度洗脫條件為時(shí)間：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%時(shí)，藍(lán)莓粗提物的分離效果最好。

綜上所述，在色譜條件篩選中所確定的各項(xiàng)最佳條件的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)一步優(yōu)化，確定了最終實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：當(dāng)流動(dòng)相為：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)；波長(zhǎng)為529 nm；流速1 mL/min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫條件為：時(shí)間：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%，此條件下藍(lán)莓粗提物的HPLC圖譜分離效果較好。