馮騰壘,曹彥衛(wèi),張夢雪,李 云,郭琳琳,楊 健,宋 瑞
(1. 石家莊畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測中心 050041; 2. 河北省林草花卉質(zhì)量檢驗檢測中心 050081;3. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司 100015; 4. 石家莊市農(nóng)業(yè)行政綜合執(zhí)法支隊 050000)
β-受體激動劑是一種母核為苯乙醇胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì),按照苯環(huán)上取代基的不同,可分為苯胺型和苯酚型,而苯酚型β-受體激動劑有分為鄰苯二酚型、間苯二酚型及水楊醇型,其結(jié)構(gòu)式如下圖所示。
圖1 β-受體激動劑分子結(jié)構(gòu)式
β-受體激動劑屬于苯乙醇胺類藥物,在醫(yī)學上其可用于治療支氣管疾病和肺炎,但在動物試驗中發(fā)現(xiàn),當用藥量超過規(guī)定劑量的5~10倍時,會在生物體內(nèi)產(chǎn)生“再分配現(xiàn)象”。其結(jié)果使動物體內(nèi)營養(yǎng)組分由脂肪轉(zhuǎn)向至肌肉組織,增加了脂肪的分解代謝、使體內(nèi)蛋白質(zhì)合成增多,使用藥個體體重增加,因此被一些養(yǎng)殖戶非法用于畜牧飼養(yǎng),導致動物源性食品中β-受體激動劑嚴重超標。人體長期食用含有β-受體激動劑的食品,將對其健康產(chǎn)生傷害,可致使用者發(fā)生肌肉震顫、心律不齊、暈眩等不良反應(yīng),尤其對于孕婦、體質(zhì)虛弱者等,副作用更大,因此各國嚴禁將β-受體激動劑用于動物養(yǎng)殖中。
目前,檢測動物源性食品中β-受體激動劑的方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,高效液相色譜法,免疫親和色譜法,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。由于該類化合物種類多,性質(zhì)相差較大,以往檢測方法靈敏度較低、適用范圍少、操作流程復雜等缺點,難以同時檢測多種β-受體激動劑。因此,需要建立快速測定動物源性食品中的多種β-受體激動劑的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。
針對現(xiàn)有方法靈敏度低、同時檢測化合物種類少等缺點,基于SCIEX Triple QuadTM 5500系統(tǒng),建立了快速檢測豬肉中的30種β-受體激動劑的方法,該方法檢測化合物具有種類全、靈敏度高、回收率好、分析速度快好等特點。
Sciex 5500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司)、MS3 digital渦旋混合器(德國IKA公司)、渦旋混勻儀(德國heidolph公司)、ROTINA 380R冷凍離心機(德國Hettich公司)、氮吹濃縮儀(美國Horizon technology公司)、S210型pH計(美國梅特勒公司)、PPM48正壓固相萃取儀(美國J2 Scientific公司)。
β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶(上海安譜實驗科技有限公司),甲醇、甲酸均為色譜純,購自天津阿爾塔科技有限公司,乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚均為分析純,購自天津科密歐化學試劑有限公司,固相萃取柱為Agela Cleanert MCX。
氯丙那林、西馬特羅、特布他林、妥布特羅、塞布特羅、沙丁胺醇、齊帕特羅、克侖丙羅、克倫特羅、利托君、噴布特羅、萊克多巴胺、馬布特羅、克侖賽羅、馬噴特羅、拉貝洛爾、苯乙醇胺A、苯氧丙酚胺、溴布特羅、班布特羅、沙美特羅、3-甲氧酪胺、福莫特羅、非諾特羅、溴氯布特羅、克侖潘特、多巴胺、奧西那林、異克侖潘特、丙卡特羅,均為天津阿爾塔科技有限公司標準液,濃度為100mg/L。
混合標準中間液:將30種β-受體激動劑標準液用甲醇稀釋成濃度為1mg/L的混合標準中間儲備液,保存在棕色瓶中-20℃。
混合標準工作溶液:使用前,用乙腈-1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸水溶液將中間儲備液稀釋成適當濃度的混合標準工作液。
準確稱量2.0g豬肉試樣置于50mL離心管內(nèi),加入0.2mol/L乙酸銨溶液(pH=5.2)8mL,再加入40μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶,渦旋混勻,在37℃避光水浴條件下振蕩16h。
酶解完成后,靜置至室溫,10000r/min高速離心10min,將上清液倒入另一50mL離心管中,加入5mL 0.1mol/L高氯酸溶液,渦旋混勻后,接著用高氯酸調(diào)pH至1.0±0.2,10000r/min離心10min后,將上清液倒入另一50mL離心管內(nèi)。用飽和NaOH溶液調(diào)pH至9.5±0.2,加入15mL乙酸乙酯,渦旋混合后,振蕩10min,5000r/min離心5min,將有機相倒入另一50mL離心管內(nèi)。再在下層水相中加入叔丁基甲醚10mL,渦旋混勻,并振蕩10min,5000r/min離心5min,合并有機相,50℃下氮氣吹干,用2%甲酸溶液5mL溶解,備用。
分別用3mL甲醇、3mL水、3mL 2%甲酸溶液活化固相萃取柱,將上述備用液過柱,隨后用2%甲酸溶液、甲醇各3mL淋洗固相萃取柱,吹干,用2.5mL 3%氨水甲醇溶液洗脫;將洗脫液在50℃下用氮氣吹干。用0.2mL甲醇-0.1%甲酸溶液溶解殘留物,渦旋混勻,15000r/min高速離心10min,取適量上清液,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
色譜柱:Phenomenex F5,2.6μm,3.0mm×100mm
流動相:A:水(1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸)
B:乙腈
流速:0.6mL/min
進樣量:5μL
梯度洗脫程序:如表1所示
表1 液相梯度設(shè)置
掃描方式:MRM采集模式,正離子掃描
離子源:ESI源
離子源參數(shù):
IS電壓:5500 V
源溫度 TEM:600℃
氣簾氣 CUR: 30 psi 碰撞氣 CAD: Medium
霧化氣 GS1: 55 psi 輔助氣 GS2: 60 psi
分別用乙腈-水溶液、乙腈-0.01%甲酸水溶液和乙腈-(1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸)水溶液3種體系作為流動相,比較在相同洗脫模式下化合物的響應(yīng)和出峰情況。結(jié)果表明,流動相體系中加入適量的甲酸,可提高化合物的靈敏度,而作為緩沖鹽甲酸銨的加入,則可改善化合物峰形的拖尾,尤其對出峰比較靠前的3-甲氧酪胺和奧西那林,峰形有明顯改善。因此,最終選定流動相體系為乙腈-(1mmol/L甲酸銨+0.01%甲酸)水溶液。
利用針泵直接進樣的方式,將30種β-受體激動劑的標準溶液(50ng/mL)以7μL/min的流速直接注入Triple QuadTM 5500質(zhì)譜儀中,在電噴霧電離正離子模式(ESI+)下,對目標物進行Q1 MS全掃描,得到母離子信息,接著母離子進行(MS2)二級掃描,得到定性和定量子離子信息,然后在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下,對相應(yīng)離子對的去簇電壓、碰撞能量和碰撞池出口電壓的參數(shù)進行優(yōu)化。
取混合標準工作溶液,在該色譜-質(zhì)譜條件下進行測定,得到的總離子流圖如圖2所示,30種β-受體激動劑均實現(xiàn)了很好的分離,分離度好且保證了良好的峰形。
圖2 30種β-受體激動劑的總離子流圖
稱取不含待測物組分的試樣各2.0g,分別添加三個不同濃度,在每個濃度中做6個平行樣?;旌暇鶆蚝?,依據(jù)前處理方法處理樣品,并在此實驗條件下測定。結(jié)果表明,不同濃度的基質(zhì)回收率為78%~109%,相對標準偏差RSD為1.3%~4.6%,這表明此方法的回收率高,通用性好,可以用來檢測不同動物源性食品中的30種β-受體激動劑。
采用該方法,測試石家莊超市中購買的豬肉和雞肉產(chǎn)品中的30種β-受體激動劑的含量,結(jié)果均為未檢出。
本研究利用 液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng),建立了可以同時測定豬肉中的30種β-受體激動劑的檢測方法;一針進樣,9min完成了30種β-受體激動劑準確定性和定量的測定;本實驗驗證了實際樣品在三個濃度范圍的添加回收率,結(jié)果均在78%~109%,相對標準偏差為1.3%~4.6%。經(jīng)過檢測實際樣本,未檢出β-受體激動劑。該方法快速、準確、全面的完成了豬肉中的30種β-受體激動劑的測定。