王志強(qiáng) 張慧華(南陽市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，河南南陽 473000； 河南民興生物科技股份有限公司，河南社旗 473300)

蠶絲由內(nèi)層絲素和外層絲膠2部分組成[1]，絲膠包覆在絲素外圍，對絲素起著保護(hù)和膠黏作用，可防止因織造摩擦對絲纖維的損傷[2]，一般要到染色、整理工序時才將絲膠全部脫凈[3]。絲綢絹紡廠精練液的廢水中含有濃度極高的絲膠蛋白[4]，直接排放流入河道會消耗水中的溶解氧，使水體喪失自凈能力，破壞人類生態(tài)環(huán)境。但是，以往很多工廠都是將絲膠廢水作為環(huán)境污染物處理，絲膠的價值沒有得到很好的利用，而又容易造成環(huán)境污染。而絲膠的提取[5]和利用一方面可以減輕絲膠廢水對自然環(huán)境造成的壓力，另一方面將絲膠作為自然資源開發(fā)并利用，對增加經(jīng)濟(jì)效益也具有深遠(yuǎn)的意義。絲膠蛋白以其獨(dú)特的優(yōu)異性能，用途日趨擴(kuò)大，產(chǎn)品日益增多，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在化妝品添加劑[6]、醫(yī)藥[7]、織物后整理涂層[8]以及功能性生物材料[6]等方面。近年來，絲膠蛋白作為生物材料的應(yīng)用研究日趨活躍，明確絲膠蛋白的細(xì)胞相容性[9-10]是絲膠蛋白在醫(yī)學(xué)組織工程材料[11]領(lǐng)域應(yīng)用的必要前提，而其良好的細(xì)胞黏附活性是絲膠蛋白細(xì)胞相容性的突出表現(xiàn)之一。然而，現(xiàn)階段對從廢水中回收的絲膠蛋白的相對分子量鮮有報道，且其細(xì)胞相容性暫不明確，為此開展了從廢水中回收不同分子量大小的絲膠蛋白對細(xì)胞的影響試驗(yàn)，以期為絲膠蛋白在醫(yī)學(xué)組織工程的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試絲膠蛋白粉 利用膜過濾技術(shù)從桑條吐精煉液中提取的高分子量絲膠蛋白(HS)和低分子量絲膠蛋白(LS)，河南民興生物科技股份有限公司絲膠提取設(shè)備生產(chǎn)，蛋白質(zhì)含量93.6%(純度93.6%)，具體生產(chǎn)方法參見文獻(xiàn)[12]。

1.1.2 主要試劑 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)無血清培養(yǎng)基套裝(MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基+MSC無血清添加劑)、胰蛋白酶消化液、小牛血清(FBS)，均購自北京科霖恩生物科技有限公司，以上試劑均為細(xì)胞級；間充質(zhì)干細(xì)胞，由北京科霖恩公司郭子寬教授贈送；碳酸鈉、檸檬酸三鈉、濃鹽酸、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購自國藥試劑，均為分析純；三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) methyl aminomethane THAM，Tris]、4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)、四甲基乙二胺(N，N，N′，N′-tetramethyl ethylenedia mine，TEMED)、過硫酸銨(ammonium persulphate，APS)、甲醇、冰醋酸、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Marker(M①11.0～180.0 kD、M②14.4～97.4 kD、M③3.3～20.1 kD)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、甘氨酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、考馬斯亮藍(lán) G-250，購自北京索萊寶有限公司，均為分析純；噻唑藍(lán)(MTT)、木瓜蛋白酶、纖維素酶、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，購自美國-Sigma-公司，均為分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 溫水浴鍋、PHS-3E型pH計、超純水機(jī)、鼓風(fēng)干燥箱，均為浙江力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；752N型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-300型電泳儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜、酶標(biāo)儀、電動移液器，均為Thermo公司產(chǎn)品；電子天平，精度0.001 g，上海恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；磁力攪拌器，常州市金壇大地自動化儀器廠產(chǎn)品；血球計數(shù)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、150 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、50 mL離心管、移液管，均為美國Corning公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離膠的配制 取27.23 g的Tris溶解于80 mL 蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.8，蒸餾水定容至150 mL。量取其中20 mL溶液，加入40 mL 30%的丙烯酰胺貯液、1 mL 10%的SDS和18 mL蒸餾水混勻，即配制成15%的分離膠，于4 ℃保存?zhèn)溆?；量取其中?0 mL溶液，加入54 mL 30%的丙烯酰胺貯液、1 mL 10%的SDS和4 mL蒸餾水混勻，即配制成20%的分離膠，于4 ℃保存?zhèn)溆?。分別量取15%和20%的分離膠9.95 mL，加入100 μL 10%的APS和5 μL的TEMED混勻，灌入膠板中，上層加入蒸餾水封口，等待分離膠凝固，即制成15%和20%的分離膠膠板。

1.2.2 濃縮膠的配制 (1)將6.00 g的Tris溶解于60 mL 蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值至6.8，蒸餾水定容至100 mL。(2)量取步驟(1)中的溶液2.5 mL，加入3.4 mL 30%的丙烯酰胺貯液、0.2 mL 10%的SDS和13.6 mL蒸餾水混勻，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?3)量取步驟(2)中的溶液10 mL，加入20 μL 10%的APS和10 μL的TEMED混勻，待1.2.1項(xiàng)的分離膠凝固后，倒出表面的水層，將配制好的濃縮膠灌入膠板中，然后插入梳子，等待凝固，即制成15%和20%的分離膠體系。

1.2.3 完全培養(yǎng)基的配制 量取16 mL的MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基于50 mL離心管中，加入4 mL的FBS，用MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至20 mL，即為完全培養(yǎng)基。

1.2.4 MTT溶液的配制 準(zhǔn)確稱取50.00 mg的MTT溶解于4.5 mL的MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，然后再用MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至5.0 mL，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 其他試劑的配制 (1)10%APS的配制。準(zhǔn)確稱量1.00 g的APS溶解于8 mL蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至10 mL，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)10%SDS的配制。準(zhǔn)確稱量10.00 g的SDS溶解于80 mL蒸餾水中，50 ℃加熱溶解，然后用蒸餾水定容至100 mL，于室溫保存?zhèn)溆谩?3)30%丙烯酰胺貯液的配制。精確稱取29.00 g的丙烯酰胺和1.00 g的N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，溶解于80 mL蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至100 mL，過濾后避光于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 絲膠蛋白分子量的測定 試驗(yàn)采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE法)測定絲膠蛋白的相對分子量。將從桑條吐精煉液中提取的HS和LS溶液用純化水稀釋至體積質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，并與含β-巰基乙醇的蛋白上樣緩沖液充分混合，煮沸3 min離心備用。HS在15%的分離膠體系下進(jìn)行，LS在20%的分離膠體系下進(jìn)行。上樣(每孔上樣量為10 μL，共10孔)，在80 V電壓下電泳30 min，120 V電壓下電泳1 h，取出凝膠，固定(甲醇∶冰醋酸=4∶1，100 mL)，用考馬斯亮藍(lán)溶液染色4 h以上，染色結(jié)束后脫色(甲醇∶冰醋酸=5∶1，100 mL)3～5次，每次間隔40～60 min直到蛋白質(zhì)條帶清晰可見，與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品條帶比對確定絲膠蛋白的相對分子量。

1.2.7 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 將HS和LS分別用MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至體積質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液為試驗(yàn)組，以體積質(zhì)量濃度為100 μg/mL的FN[12-14]為陽性對照組，以PBS為陰性對照組，共6組，每組分別做12個平行。上述各組分別以100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，4 ℃過夜，完成包被。將包被過夜的96孔板用PBS洗滌2～3次，然后加入細(xì)胞，密度為104個/孔，再加入含體積質(zhì)量百分比為0.5%的FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 μL，在37 ℃下孵育20 min，去除液體，再次用PBS洗滌2～3次，去除未貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用MTT比色法檢測細(xì)胞的生長情況，具體過程如下：用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，每孔再加入20 μL體積質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去上清液，加入150 μL/孔的DMSO振蕩5～10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇在490 nm波長下，用酶標(biāo)儀測其吸光度值，重復(fù)測定3次，并以試驗(yàn)各組及陽性和陰性對照組為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖，對比分析HS和LS在同一體積質(zhì)量濃度下的細(xì)胞黏附活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲膠蛋白相對分子量的確定

通過SDS-PAGE 法測定絲膠蛋白LS和HS的分子質(zhì)量分布。從圖1可以看出，利用膜過濾技術(shù)制備的HS分子量主要分布在31.0～97.4 kD之間，LS分子量分布在7.8～31.0 kD之間。

HS表示高分子量絲膠蛋白，LS表示低分子量絲膠蛋白。圖1 HS(A)和LS(B)的SDS-PAGE法測定的分子質(zhì)量圖譜

2.2 絲膠蛋白HS和LS的細(xì)胞黏附活性

試驗(yàn)以體積質(zhì)量濃度為100 μg/mL的FN為陽性對照，以PBS為陰性對照，HS和LS等2種分子量大小的絲膠蛋白在0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL體積質(zhì)量濃度下均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞黏附活性，具體如圖2所示。從圖2可以看出,在同一體積質(zhì)量濃度下經(jīng)HS包被處理過夜的試驗(yàn)組對間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附活性極顯著高于(P<0.01)LS包被處理過夜的試驗(yàn)組。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同分子量的絲膠蛋白對間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附活性產(chǎn)生了重要影響。

柱圖為490 nm波長下的吸光度值。圖2 MTT法檢測經(jīng)HS和LS包被處理96孔板過夜后對間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附活性

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)采用SDS-PAGE法測定利用膜過濾技術(shù)從桑條吐精煉液中回收提取的高分子量絲膠蛋白的分子量分布在31.0～97.4 kD之間，低分子量絲膠蛋白的分子量分布在7.8～31.0 kD之間。

絲膠蛋白用于生物醫(yī)學(xué)材料時，必須要有良好的生物相容性，細(xì)胞在相關(guān)材料上的黏附活性是評價絲膠蛋白生物相容性的重要指標(biāo)之一[9-10]。本試驗(yàn)通過膜過濾技術(shù)制備了高分子量和低分子量絲膠蛋白用于探究其做為生物材料構(gòu)建的可行性，用2種不同分子量的絲膠蛋白包被處理96孔板過夜后，用MTT法檢測其對細(xì)胞的黏附活性，試驗(yàn)結(jié)果表明，從桑條吐精煉液中利用膜過濾技術(shù)回收的高分子量絲膠蛋白和低分子量絲膠蛋白均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞黏附活性，且在同一體積質(zhì)量濃度下高分子量絲膠蛋白各試驗(yàn)組極顯著高于(P<0.01)低分子量絲膠蛋白各試驗(yàn)組，這可能與絲膠蛋白的純度有很大的關(guān)系，在蠶絲脫膠過程中的各種化學(xué)藥劑殘留為主要原因，這也為絲膠蛋白的提純技術(shù)提出了更高的要求。本試驗(yàn)驗(yàn)證了絲膠蛋白生物相容性對細(xì)胞的黏附活性的影響，為其在醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的開發(fā)提供了理論依據(jù)。