張 彥 張 勇 秦 鳳 石 涼 童曉琪 黃 浩 黃德輝( 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,安徽合肥 3006; 六安市金安區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,安徽六安 37007)
暗化型家蠶自發(fā)現(xiàn)以來(lái),就因其全齡期表現(xiàn)黑化表型而備受矚目,特別是其蛾期全身包括蛾翅在內(nèi)均呈黑褐色,明顯地區(qū)別于普通蠶蛾的白色或淡黃色,家蠶育種專(zhuān)家利用這一特點(diǎn)培育出黑白分明的雙親,把家蠶一代雜交種的雜交率提高到99%以上,從而在顯著提高家蠶一代雜交種質(zhì)量的同時(shí),大幅減少了蠶種場(chǎng)剔除純對(duì)、保持雜交率方面的用工[1-4]。安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶育種組工作人員在對(duì)暗化型品系580進(jìn)行選育的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)了幼蟲(chóng)期頭、胸足等骨化部位和蛹期后期、蛾期等發(fā)育階段體色均比正常暗化型家蠶著色較淺的群體——淺580。通過(guò)觀察統(tǒng)計(jì)580與淺580家蠶個(gè)體除在著色上有差別以外,在蟲(chóng)體形態(tài)、眠起時(shí)間、蟲(chóng)蛹率等生理方面并沒(méi)有差別,并通過(guò)對(duì)家蠶品系淺580做遺傳調(diào)查后發(fā)現(xiàn)淺暗化型突變與暗化型突變一樣,相對(duì)于普通白蛾表型為隱性遺傳[5]。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),家蠶淺暗化型突變品系淺580第7天蛹體內(nèi)暗化突變基因BmiAANAT(mln)與黑色素代謝通路上另一條表達(dá)產(chǎn)物同樣具有催化多巴胺功能的基因BmiAANAT2的表達(dá)量相對(duì)于家蠶暗化型突變品系580均大幅下調(diào),并推測(cè)該變化是引起淺580發(fā)生的主要原因[5]。為驗(yàn)證該推測(cè)并進(jìn)一步揭示淺暗化型家蠶的發(fā)生機(jī)理,增強(qiáng)對(duì)家蠶黑色素代謝調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí),本研究設(shè)計(jì)了通過(guò)利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析580及淺580第8天蛹體內(nèi)多巴和多巴胺等黑色素前體物質(zhì)含量變化的試驗(yàn)?,F(xiàn)將有關(guān)情況報(bào)告如下,供同仁參考。
1.1.1 供試家蠶 暗化型家蠶品系580、淺暗化型家蠶品系淺580,均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶育種組培育,在適宜條件下飼養(yǎng)、上蔟、結(jié)繭、化蛹,蛹期第8天時(shí),用純水輕柔沖洗,瀝干后于-80 ℃ 儲(chǔ)存、備用。
1.1.2 主要試劑 左旋多巴(色譜純,D9628)、鹽酸多巴胺(色譜純,H8502)、乙腈(色譜純,34851),均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;甲酸(色譜純,85174),美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。
1.1.3 主要儀器設(shè)備 Agilent1290液相色譜儀、SB-PHENYL色譜柱(2.1 mm×100.0 mm,1.8 μm)、Agilent 6460 LC/MS 液質(zhì)聯(lián)用儀,均為安捷倫科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品;JK 3200B超聲波清洗器,上海超聲波儀器公司產(chǎn)品;BP211D電子天平,德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品;冷凍干燥器,美國(guó)熱電公司產(chǎn)品。
1.2.1 甲酸溶液的配制 稱(chēng)取0.1 mL甲酸用去離子水溶解并定容至100 mL,配制成體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液。
1.2.2 樣品的獲取及提取 取580及淺580第8天的蠶蛹各20頭,分別使用凍干機(jī)冷凍干燥,高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)100目篩。各稱(chēng)取5.0 mg樣品,加入5.0 mL甲酸、5.0 mL乙腈和40.0 mL純水,渦旋1 min,混勻后15 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)樣。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制 取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液,加水分別配制成濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液,過(guò)0.22 μm濾膜,LC-MS/MS分析。
1.2.4 液相及質(zhì)譜條件 流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,柱溫35 ℃,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL;霧化器溫度350 ℃,霧化器流速10 L/min,鞘氣溫度350 ℃,鞘氣流速12 L/min,采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),條件如表1所示。
表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)參數(shù)
如圖1和圖2所示,圖1-A是多巴標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖,多巴的保留時(shí)間為0.89 min;圖1-B是樣品的色譜圖,分析物的保留時(shí)間分別出現(xiàn)在0.89 min和1.24 min,對(duì)比圖1-A保留時(shí)間在0.89 min所示的物質(zhì)應(yīng)是多巴。圖2-A和圖2-B所示分別為多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖,所示物質(zhì)的保留時(shí)間均在0.98 min,兩者應(yīng)為同一物質(zhì)即多巴胺。
圖1 多巴標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)的色譜圖
圖2 多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)的色譜圖
圖3所示為以多巴標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸和相應(yīng)檢測(cè)值為Y軸制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程為y=1 337.431 68x+2 085.691 49(r=0.992 63),在10~200 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。圖4所示為以多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸和相應(yīng)檢測(cè)值為Y軸制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程為y=1 652.106 72x+9 033.529 10(r=0.999 85),在10~200 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。
圖3 多巴標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
圖4 多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
從圖5可以看出:淺580第8天脫水干蠶蛹體內(nèi)多巴和多巴胺的含量分別為79 955 μg/kg和1 035 μg/kg;580第8天脫水干蠶蛹體內(nèi)多巴和多巴胺的含量則分別為38 735 μg/kg和3 400 μg/kg。淺580第8天蛹體內(nèi)的多巴含量是580第8天蛹體內(nèi)的2倍多,差異極顯著;而淺580第8天蛹體內(nèi)所含的多巴胺含量卻不到580第8天蛹體內(nèi)含量的1/3,差異水平也達(dá)到了極顯著。淺580與580蛹體內(nèi)多巴與多巴胺這2種黑色素前體物質(zhì)含量的顯著差異導(dǎo)致的黑色素含量不同是二者表現(xiàn)出不同程度的黑化表型的直接原因。
圖5 樣品580與淺580第8天蛹體內(nèi)多巴與多巴胺含量
家蠶暗化型突變?cè)缭?961年就有了報(bào)道,但直到詹帥和代方銀等把BmiAANAT基因確定為暗化突變基因(mln)才解析了其發(fā)生的原因,該基因的表達(dá)產(chǎn)物為芳烷基乙酰轉(zhuǎn)移酶,其催化底物是多巴胺[6-7]。多巴胺是家蠶黑色素代謝通路的關(guān)鍵物質(zhì),是由酪氨酸經(jīng)酪氨酸羥化酶作用合成多巴再經(jīng)多巴脫羧酶作用生成的,下游代謝有3條轉(zhuǎn)化途徑:一是在酶的作用下與β-丙氨酸結(jié)合生成N-β-丙酰多巴胺,最后合成黃褐色的色素;二是經(jīng)芳烷基乙酰轉(zhuǎn)移酶作用轉(zhuǎn)化為N-乙?;喟桶?,最終生成無(wú)色或透明的色素;三是在一系列酶的催化下生成深棕色的多巴胺黑色素。BmiAANAT基因發(fā)生突變,使第2條途徑受阻就是暗化型家蠶的發(fā)生原因[8-11]。2015年LONG等[12]在家蠶中鑒定出了另1條AANAT基因,將其命名為BmiAANAT2,并通過(guò)基因敲除技術(shù)證實(shí)該基因編碼的酶也具有催化多巴胺形成N-乙?;喟桶返墓δ?,其表達(dá)產(chǎn)物與BmiAANAT編碼的酶相似度高達(dá)57%。
MATTHEW等[9]通過(guò)克隆基因BmiAANAT和BmiAANAT2的全長(zhǎng)序列和測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量分析了2個(gè)基因與淺暗化型家蠶形成的關(guān)系,克隆和測(cè)序結(jié)果顯示,家蠶品系580與淺580所含BmiAANAT的突變類(lèi)型是相同的,突變后的基因堿基序列與以前的報(bào)道一致;580與淺580這2個(gè)家蠶品系間BmiAANAT2的堿基序列也無(wú)差異。分析熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)量結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn),580與淺580這2個(gè)家蠶品系間BmiAANAT和BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量都存在極顯著的差異,且家蠶品系580的2個(gè)暗化突變基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。綜合分析,家蠶品系淺580的發(fā)生不是由BmiAANAT和BmiAANAT2堿基序列突變?cè)斐傻?,而與體內(nèi)這2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降有關(guān);并認(rèn)為幼蟲(chóng)期、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段淺580品系的個(gè)體都表現(xiàn)出比580品系的個(gè)體黑化程度更淺的表型特征,是源于體內(nèi)較低的黑色素含量,結(jié)合淺580個(gè)體內(nèi)BmiAANAT、BmiAANAT2的表達(dá)量大幅下調(diào),從而推測(cè)家蠶品系淺580個(gè)體內(nèi)黑色素的前導(dǎo)物多巴胺含量也應(yīng)該低于家蠶品系580。
本研究,以暗化型家蠶品系580和淺580的第8天蛹為材料,利用LC-MS/MS分析蛹體內(nèi)多巴和多巴胺等黑色素前體物質(zhì)含量變化,結(jié)果顯示,淺580第8天蠶蛹內(nèi)多巴的含量是580第8天蠶蛹的2倍多,而淺580第8天蠶蛹內(nèi)多巴胺的含量明顯低于580第8天蠶蛹。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了前期的推測(cè),也進(jìn)一步證明了淺580的淺暗化表型的發(fā)生與其體內(nèi)過(guò)低的多巴胺含量直接相關(guān),多巴胺含量的降低通過(guò)反饋調(diào)節(jié)使BmiAANAT、BmiAANAT2的表達(dá)量下調(diào)的同時(shí)也使多巴胺黑色素的生產(chǎn)量下降;但為什么淺580體內(nèi)高水平含量的多巴不轉(zhuǎn)化為多巴胺,且也沒(méi)有產(chǎn)生大量的多巴黑色素(為黑褐色)進(jìn)而使淺580表現(xiàn)出深暗化表型的機(jī)理,還需更加深入的研究。