司徒金容 何艷影 李佳璇 劉吉升(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006)

昆蟲沒有獲得性免疫系統(tǒng)(acquired immune system)，只有先天免疫系統(tǒng)(innate immune system)。昆蟲通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)來識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，繼而引發(fā)下游的細(xì)胞免疫和體液免疫[1]，對抵抗外源病原體和維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用[2]。昆蟲的先天免疫有Toll、IMD(immune deficiency,免疫缺陷)和JAK/STAT(janus kinase/signal transducer and activator of transcription,Janus激酶/信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子)等3條信號通路，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫途徑調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)抗菌肽和其他效應(yīng)分子的產(chǎn)生[3]。Toll信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對抵抗病原微生物的先天性免疫應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用[4]，其中Rel是Toll通路中的關(guān)鍵因子[5]，參與抗菌肽激活的調(diào)節(jié)[6]，在發(fā)育、炎癥、凋亡、細(xì)胞增殖和分化等許多生理過程中都起著重要的調(diào)控作用[7]。

Rel蛋白在Toll通路上的研究，目前以黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)最為深入。在黑腹果蠅中，Toll樣受體是細(xì)胞上的跨膜受體蛋白，發(fā)生微生物感染時，Toll蛋白借助它的TIR(toll/interleukin-1 receptor)結(jié)構(gòu)域與胞漿內(nèi)的MyD88(myeloid differentiation factor 88，髓樣分化因子88)和Tube蛋白相互作用。MyD88、Tube和Pelle基于Toll蛋白傳來的信號在胞漿內(nèi)形成復(fù)合體，缺失這些蛋白而無法形成復(fù)合體的果蠅不能抵御微生物感染。信號從該復(fù)合體傳給可誘導(dǎo)的Rel/NF-κB家族順式激活子。Rel/NF-κB是昆蟲和哺乳動物先天性免疫系統(tǒng)中共有的轉(zhuǎn)錄因子，與防御入侵微生物的結(jié)構(gòu)性和功能性相關(guān)[8]。該因子在胞漿中與Rel蛋白的抑制子Cactus形成復(fù)合體，促使蛋白激酶磷酸化Rel蛋白，磷酸化的Rel蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[9]。Rel/NF-κB信號通路在昆蟲體液免疫中發(fā)揮重要作用，通過活化Rel蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中與κB因子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)[10]。

家蠶(Bombyxmori)是繼黑腹果蠅、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)后第3個完成全基因組測序的模式昆蟲，也是第1個完成測序的鱗翅目昆蟲，經(jīng)全基因組篩查獲得免疫相關(guān)基因203個[11]。在家蠶中，編碼Rel蛋白的cDNA有BmRelA和BmRelB，它們除5′區(qū)域外均顯示相同的核苷酸序列，這2個Rel蛋白都參與了抗菌肽基因的激活，BmRelB強(qiáng)烈激活A(yù)ttacin和Lebocin3基因，BmRelA強(qiáng)烈激活Lebocin4基因，而Attacin和Lebocin3基因非常弱，Rel蛋白的微小結(jié)構(gòu)變化可引起抗菌肽基因的顯著差異激活，這提示Rel因子對昆蟲抗菌肽基因表達(dá)的新型調(diào)節(jié)機(jī)制[6]。

在我們前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和大腸桿菌(Escherichiacoli)給家蠶5齡幼蟲添食可以誘導(dǎo)MyD88基因在家蠶幼蟲的免疫反應(yīng)，且不同組織會出現(xiàn)不同程度的免疫反應(yīng)[12]。本研究采用體腔注射處理家蠶5齡幼蟲，利用PCR和凝膠電泳技術(shù)進(jìn)一步探究BmRelA基因?qū)χ嗵呛痛竽c桿菌的應(yīng)答情況，以期揭示BmRelA基因?qū)ν庠床≡w的免疫反應(yīng)，為深入研究家蠶Toll信號通路的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并為家蠶抗病能力及家蠶抗菌物質(zhì)的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx 本試驗(yàn)所用家蠶品系為“大造”(P50)，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所惠贈。孵化后的幼蟲在溫度(25±1)℃，相對濕度60%～70%，每日上午7：00起連續(xù)12 h光照(L)之后再連續(xù)12 h黑暗(D)(L∶D=12∶12，即L為7：00AM—7：00PM，D為7：00PM—7：00AM)的條件下，以新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq、DL2000 DNA Marker等試劑，均為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(大連TaKaRa公司)產(chǎn)品；Lipopolysaccharides fromEscherichiacoliO111：B4，為西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖M，為BBI公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 T100 Thermal Cyclers PCR儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；CentrisartA-14C離心機(jī)、BSA224S電子天平，均為Sartorius公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)、-80 ℃超低溫冰箱，均為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶幼蟲注射處理試驗(yàn)及解剖取樣 隨機(jī)選取36條5齡第1天家蠶幼蟲，以體腔注射10 μL脂多糖溶液(0.25 μg/μL)或經(jīng)滅活處理的大腸桿菌液稀釋液(2.5×104cells/μL)為試驗(yàn)組，以體腔注射10 μL無菌水為對照組，共3種處理，每種處理12頭。

在注射前0 h、注射后3 h、6 h和24 h進(jìn)行平行取樣，每種處理每個時間點(diǎn)取3頭家蠶，每頭家蠶解剖后分別取中腸、表皮和脂肪體3種組織。所有樣品迅速置于無RNA酶的離心管中，存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 使用 RNAiso Plus試劑盒，按其說明書的操作提取以上組織的總RNA，并用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，置于-80 ℃冰箱保存。

參照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明書操作，采用10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為25 ℃、10 min，42 ℃、60 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存，以此為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 目的基因的PCR擴(kuò)增 引物均使用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。檢測基因?yàn)锽mRelA基因(GenBank登錄號：NM_001043431)，內(nèi)參基因?yàn)榧倚QBmActinA3看家基因(GenBank登錄號：NM_001126254)。使用Taq試劑盒和10 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。BmRelA擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35次循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。BmActinA3擴(kuò)增條件與BmRelA稍有不同，BmActin退火溫度為53 ℃，循環(huán)數(shù)為28次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件采用100 V、14 min。溴化乙錠染色后，利用紫外凝膠成像儀觀察電泳條帶。

表1 BmRelA基因和BmActinA3基因的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Quality One圖像分析軟件對凝膠條帶進(jìn)行定量分析。參照軟件說明，通過校正原凝膠電泳圖的亮度和對比度，統(tǒng)一背景色調(diào)；調(diào)整目標(biāo)條帶寬度并重新編號計(jì)算；框選目的條帶后平衡條帶峰值；分析量化條帶亮度后導(dǎo)出數(shù)據(jù)。對脂多糖、大腸桿菌處理的試驗(yàn)組和無菌水處理的對照組進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進(jìn)行Turkey法多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對中腸組織中BmRelA基因表達(dá)的影響

瓊脂糖凝膠電泳顯示，注射處理后24 h內(nèi)BmRelA基因和BmActinA3基因在家蠶5齡幼蟲中腸組織中均有表達(dá)。經(jīng)無菌水注射處理，中腸組織中BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)的條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h和6 h條帶亮度與0 h相近，在24 h條帶亮度減弱(圖1-A)；經(jīng)脂多糖注射處理，BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h、6 h和24 h條帶亮度增強(qiáng)，在24 h時的條帶最亮(圖1-B)；經(jīng)大腸桿菌注射處理，BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h 和6 h條帶亮度與0 h相近，在24 h條帶亮度增強(qiáng)(圖1-C)。通過Quality One軟件進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無菌水注射處理，中腸組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h和6 h相比0 h無顯著差異，在24 h 有所下調(diào)；經(jīng)脂多糖注射處理，中腸組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h、6 h和24 h顯著上調(diào)；經(jīng)大腸桿菌注射處理，中腸組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h和6 h 相比0 h無顯著差異，在24 h顯著上調(diào)(圖2)。根據(jù)凝膠電泳的條帶亮度并結(jié)合Quality One軟件表達(dá)量的分析，在中腸組織中，脂多糖和大腸桿菌的注射處理均會誘導(dǎo)BmRelA基因上調(diào)表達(dá)，在測定的時間范圍內(nèi)以24 h時的誘導(dǎo)效果最好；其中，脂多糖注射處理誘導(dǎo)的效果更好。

圖1 家蠶5齡幼蟲體腔注射無菌水(A)、脂多糖(B)和大腸桿菌(C)后中腸組織中BmRelA基因的凝膠電泳圖

圖中數(shù)據(jù)為同一次試驗(yàn)的3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4和圖6相同。圖2 家蠶5齡幼蟲體腔注射無菌水、脂多糖和大腸桿菌后不同時間中腸組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量

2.2 不同處理對表皮組織中BmRelA基因表達(dá)的影響

瓊脂糖凝膠電泳顯示，注射處理后24 h內(nèi)BmRelA基因和BmActinA3基因在家蠶5齡幼蟲表皮組織中均有表達(dá)。經(jīng)無菌水注射處理，表皮組織中BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h、6 h和24 h條帶亮度減弱(圖3-A)；經(jīng)脂多糖注射處理，BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在6 h和24 h條帶亮度與0 h相近，在3 h條帶亮度減弱(圖3-B)；經(jīng)大腸桿菌注射處理，BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h條帶亮度略微增強(qiáng)，在6 h和24 h條帶亮度明顯增強(qiáng)(圖3-C)。通過Quality One軟件進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無菌水注射處理，表皮組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h、6 h和24 h有所下調(diào)；經(jīng)脂多糖注射處理，表皮組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h有所下調(diào)，在6 h、24 h相比0 h無顯著差異；經(jīng)大腸桿菌注射處理，表皮組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h、6 h和24 h顯著上調(diào)(圖4)。根據(jù)凝膠電泳的條帶亮度并結(jié)合Quality One軟件表達(dá)量的分析，在表皮組織中，大腸桿菌注射處理誘導(dǎo)BmRelA基因上調(diào)表達(dá)的效果比脂多糖注射處理誘導(dǎo)的效果更好。

圖3 家蠶5齡幼蟲體腔注射無菌水(A)、脂多糖(B)和大腸桿菌(C)后表皮組織中BmRelA基因的凝膠電泳圖

圖4 家蠶5齡幼蟲體腔注射無菌水、脂多糖和大腸桿菌后不同時間表皮組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量

2.3 不同處理對脂肪體組織中BmRelA基因表達(dá)的影響

瓊脂糖凝膠電泳顯示，注射處理后一定時間內(nèi)BmRelA基因和BmActinA3基因在家蠶5齡幼蟲脂肪體組織中均有表達(dá)。經(jīng)無菌水注射處理，脂肪體組織中BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近(圖5-A)；經(jīng)脂多糖注射處理，BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h、6 h和24 h條帶亮度增強(qiáng)(圖5-B)；經(jīng)大腸桿菌注射處理，BmActinA3基因在4個時間點(diǎn)條帶亮度相近，BmRelA基因在3 h條帶亮度增強(qiáng)，在6 h和24 h條帶亮度略微減弱(圖5-C)。通過Quality One軟件進(jìn)一步驗(yàn)證，經(jīng)無菌水注射處理，脂肪體組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在4個時間點(diǎn)無顯著差異；經(jīng)脂多糖注射處理，脂肪體組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h、6 h和24 h顯著上調(diào)；經(jīng)大腸桿菌注射處理，脂肪體組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量在3 h顯著上調(diào)，在6 h和24 h有所下調(diào)(圖6)。根據(jù)凝膠電泳的條帶亮度并結(jié)合Quality One軟件表達(dá)量的分析，在脂肪體組織中，脂多糖和大腸桿菌的注射處理均能誘導(dǎo)BmRelA基因上調(diào)表達(dá)；其中，脂多糖的注射處理誘導(dǎo)BmRelA基因上調(diào)表達(dá)的效果更好。

圖5 家蠶5齡幼蟲體腔注射無菌水(A)、脂多糖(B)和大腸桿菌(C)后脂肪體組織中BmRelA基因的凝膠電泳圖

圖6 家蠶5齡幼蟲體腔注射無菌水、脂多糖和大腸桿菌后不同時間脂肪體組織中BmRelA基因的相對表達(dá)量

3 小結(jié)與討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因蠶病造成蠶繭經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20%左右[13]。因此，開展家蠶天然免疫系統(tǒng)的研究，有助于對家蠶免疫基因的了解，以提升其抵御外源病原體的能力。家蠶既是支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的生物基礎(chǔ)，又是鱗翅目昆蟲研究的典型模式種類，通過對家蠶免疫相關(guān)基因的研究，可為其他生物的相關(guān)疾病研究提供一定的比較和參考。

本試驗(yàn)對家蠶5齡幼蟲進(jìn)行脂多糖注射處理，結(jié)果顯示，脂多糖注射處理后，引起中腸和脂肪體組織中BmRelA基因上調(diào)表達(dá)。脂多糖是大多數(shù)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能誘發(fā)宿主細(xì)胞固有免疫反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)組成與細(xì)菌致病能力息息相關(guān)[14]。大腸桿菌注射處理試驗(yàn)顯示，在3個組織中BmRelA基因都出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)。

通過比較脂多糖和大腸桿菌誘導(dǎo)BmRelA基因的表達(dá)水平，可以推斷，脂多糖和大腸桿菌均能夠誘導(dǎo)BmRelA基因的上調(diào)表達(dá)。在表皮組織中，大腸桿菌誘導(dǎo)BmRelA基因上調(diào)表達(dá)的誘導(dǎo)效果更好；在中腸和脂肪體組織中，脂多糖的誘導(dǎo)效果更好。推測可能是由于脂多糖僅是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分之一[15]，大腸桿菌細(xì)胞壁中脂多糖含量較低，不如脂多糖注射處理試驗(yàn)組的脂多糖溶液含量高，故注射脂多糖誘導(dǎo)家蠶幼蟲BmRelA基因的上調(diào)表達(dá)更顯著。

家蠶模式識別受體的發(fā)現(xiàn)是家蠶先天免疫研究的開始，昆蟲的某些特定器官也有特定的免疫作用。中腸是昆蟲免疫重要的物理屏障和腸道的重要免疫中心[16-17]；表皮是微生物的主要防御系統(tǒng)，其腺體可以分泌防御性物質(zhì)，以驅(qū)除捕食者和寄生者[18]；脂肪體作為重要的免疫反應(yīng)器官，分泌合成了多種與分子免疫相關(guān)的蛋白，如抗菌肽Cecropins、Defensins等[19]。脂多糖注射處理后3 h、6 h和24 h，均誘導(dǎo)BmRelA基因在中腸和脂肪體組織中上調(diào)表達(dá)，說明BmRelA可能在其中參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。大腸桿菌注射處理后3 h，脂肪體組織中BmRelA基因上調(diào)表達(dá)，直至大腸桿菌注射處理后24 h，中腸組織中BmRelA基因才上調(diào)表達(dá)，由大腸桿菌誘導(dǎo)BmRelA基因上調(diào)表達(dá)出現(xiàn)的時間推測，外源病原體引起家蠶體液免疫調(diào)節(jié)的順序如下：首先，在脂肪體組織中引起體液免疫，緊接著在中腸組織中引發(fā)，家蠶腸道在細(xì)菌感染后期產(chǎn)生的抗菌肽扮演著清除腸道內(nèi)細(xì)菌的角色[15]，免疫調(diào)節(jié)的作用較強(qiáng)。梁九波[20]的微生物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，家蠶表皮蛋白BmCPT1經(jīng)微生物誘導(dǎo)后僅能在家蠶血漿中被檢測到，而一些免疫相關(guān)蛋白也與此相類似。由此推測，家蠶表皮能夠傳遞外界不良的刺激，而引起下游的免疫聯(lián)級反應(yīng)，在其他組織引起相關(guān)免疫基因的上調(diào)表達(dá)。

脂多糖為哺乳動物TLR4 (toll-like receptor 4)的主要配體，TLR4通過識別并結(jié)合相應(yīng)配體，啟動激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過刺激TIR超家族成員激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[21-22]，釋放NF-κB中常見的p60/p50和p50/c-Rel二聚體或p52/RelB迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)控各種κB依賴基因的表達(dá)[23]。昆蟲的Toll9受體和哺乳動物TLR4進(jìn)化關(guān)系較為接近，由此推測在家蠶Toll通路中有與哺乳動物TLR4相似的脂多糖誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

綜上所述，BmRelA基因在家蠶幼蟲的中腸、表皮和脂肪體組織中被外源病原菌在不同程度誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測BmRelA基因參與了對這些外源病原菌的免疫應(yīng)答。后期還需要進(jìn)行家蠶幼蟲喂食脂多糖的試驗(yàn)，對比喂食試驗(yàn)有助于研究家蠶從口中攝入細(xì)菌和從體表注射細(xì)菌后BmRelA基因表達(dá)的區(qū)別，進(jìn)一步了解和完善家蠶Toll信號通路的免疫機(jī)制。