湛志華，陳茺而，莫大幸，謝木標，薛茗月，*，韓國成，毛惠會，鐘菁青

(1. 嶺南師范學院 化學化工學院，廣東 湛江 524048；2. 桂林電子科技大學 生命與環(huán)境科學學院，廣西 桂林 541004)

1 引 言

碳量子點(CDs)是繼富勒烯、碳納米管、石墨烯之后最受關注的碳基納米材料。從2004年Xu等[1]通過電弧放電的方法第一次得到這種具有明亮熒光的納米粒子到2006年Sun等[2]以水蒸氣為載體激光燒蝕碳靶制得碳點、進行表面鈍化并首次提出碳量子點的概念以來，CDs因其形貌為小于10 nm的類球形結構、有大的Stokes位移[3]、低毒性、生物相容性好[4]、制備簡單、熒光性能穩(wěn)定及易于表面修飾[5]等優(yōu)點，被廣泛應用于生物傳感[6-7]、光學成像[8-9]、藥物載送[10]、光催化[11-12]等領域。此外，碳點還具有光引發(fā)電子轉移的行為，其在光伏設備及光捕獲材料上也有潛在的應用價值[13]。

自碳點被發(fā)現(xiàn)以來，制備方法就一直不斷地豐富且向著綠色環(huán)保、安全高效、操作簡單等方向發(fā)展，主要分為自上而下法(Top-down)和自下而上法(Bottom-up)兩類。自上而下法包括：激光燒蝕法、電化學法、氧化石墨烯法、弧光放電法等，是由宏觀尺寸的碳經過加工變?yōu)榧{米顆粒的方法，產物大多為混合物，需要一定的分離提純工序，合成效率較低。自下而上法有：水熱法、微波法、溶劑熱法、熱解法、激光化學反應法等，是將有機碳化合物分子合成為納米粒子，制備工藝簡單，有的甚至能一步合成碳點，且實驗設備要求低，適合大規(guī)模制備，是目前采用比較多的一種制備方法[14]。

目前報道的熒光碳點發(fā)光主要集中在藍綠光[9,14-15]，與生物體自身熒光背景相近，不利于其在細胞成像中應用。而紅光和近紅外光碳點的報道較少，且前軀體的選擇多為化學試劑，制備工藝繁瑣，熒光量子產率偏低[16-18]。因此，探索綠色天然物質制備CDs的工藝，制備出高熒光產率的紅光或近紅外光碳點甚至更長波長的光，將有力推進碳點在生物醫(yī)學領域、水處理環(huán)境保護領域、量子點敏化太陽能電池、光催化合成化學品等眾多研究領域的應用。單發(fā)射探針不可避免地受到生物樣品不均、儀器激發(fā)光波動、探針濃度不均一等環(huán)境因素影響[19]，單激發(fā)雙發(fā)射的比率熒光分析方法能有效克服上述缺點。比率熒光傳感器可消除外界因素變化對測量信號強度的影響，例如比率熒光探針濃度、光源不穩(wěn)定和生物組織背景熒光等；也可以消除假陽性信號，例如光漂白、細胞膜厚度、探針在細胞內或者不同細胞之間的差異造成的不均勻分布等引起的失真信號[20-22]。

基于此，本文以綠色生物質高山榕樹葉為碳源，通過溶劑熱法一步合成了單激發(fā)雙發(fā)射近紅外比率型熒光CDs。采用TEM、XRD和FT-IR等手段對其粒徑大小及分布、形貌、表面官能團等進行了表征，并探討了CDs耐酸堿、光學、抗鹽以及細胞成像效果。

2 實 驗

2.1 碳量子點(CDs)合成

將洗凈的新鮮高山榕樹葉打碎，加入50 mL的無水乙醇和50 mL丙酮混合，浸泡提取30 min后，取上層清液25 mL放入聚四氟乙烯反應釜，于電烘箱中200 ℃加熱10 h。冷卻至室溫后10 000 r/min離心10 min，轉移至透析袋中避光透析2 h，得到合成的CDs，用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，于4 ℃冰箱保存，實驗前用超純水稀釋。

2.2 實驗儀器

FluoroMax-4型熒光光譜儀(Horiba，F(xiàn)rance)用于熒光光譜測定；T9型紫外-可見分光光度計(普析，北京)用于紫外-可見吸收光譜測定；Philips Tecnai G2 F20 S-TWIN場發(fā)射透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM,PhilipS,Netherlands)用于CDs粒徑的測定；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)用于CDs表面基團表征；X’pert Pro MPD X射線衍射儀(PANalytical，Netherlands)用于CDs形貌表征；Zeiss LSM710 共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)(CLSM，Zeiss，Germany)用于細胞成像的測定。除細胞毒性實驗外，其他實驗CDs的濃度均為100 μg/mL。所有實驗均在室溫下完成。

3 結果與討論

3.1 CDs的表征

從CDs的透射電鏡(TEM)圖(圖2)可以看出，合成的CDs分散性好、粒徑較小、比較均勻(2.0～8.0 nm)，幾乎90%的CDs的粒徑集中在3.0～6.0 nm之間(圖2(c))。平均尺寸約為4.70 nm，粒徑小，有利于CDs進入細胞。圖2(b)為CDs的高分辨透射電鏡圖，晶格常數(shù)為0.32 nm，與石墨烯的(002)面一致。

圖1 CDs的合成路線及應用

圖2 CDs 的TEM 圖像(a)、高分辨TEM 圖像(b)及粒徑分布圖(c)。

為得到合成CDs的晶面常數(shù)，進行XRD表征得到圖3，CDs在2θ=22°處有一個較寬的衍射峰，表明得到的碳點中心為sp2雜化的無定型碳。

圖3 CDs的XRD圖

通過傅里葉紅外光譜儀對碳點表面基團進行檢測，結果如圖4。3 457 cm-1處的寬峰表示樣品

圖4 CDs的FT-IR圖

3.2 CDs的光學性質

如圖5所示，所得的CDs在紫外和可見光區(qū)均有明顯的吸收，且在360 nm激發(fā)波長下發(fā)出紅色熒光。從熒光光譜可以看到該CDs的最大激發(fā)波長為410 nm，最大發(fā)射波長為466 nm和676 nm，表示合成的碳點具有單激發(fā)雙發(fā)射近紅外熒光特性，可構建比率型熒光探針。

圖5 CDs的紫外吸收光譜和激發(fā)、發(fā)射熒光光譜。

以硫酸奎寧作為參比，在360 nm激發(fā)波長下，按照公式

(1)

計算得到該CDs熒光量子產率為26.31%。其中φx和φs分別表示待測物質和參比物質的熒光量子產率，F(xiàn)x和Fs分別表示待測物質和參比物質的

積分熒光強度，Ax和As分別表示待測物質和參比物質對該波長激發(fā)光的吸收強度。

圖6為不同激發(fā)波長下CDs的發(fā)射光譜，由圖中可知，隨著激發(fā)波長從360 nm增加到410 nm，466 nm處的最大發(fā)射峰稍有紅移，具有激發(fā)依賴性；676 nm處的發(fā)射峰位置不變，熒光強度逐漸增加。從3D圖(圖7)也可明顯看出，隨著激發(fā)波長增加，676 nm處的發(fā)射峰熒光強度逐漸增大。

圖6 不同激發(fā)波長下CDs的熒光發(fā)射光譜

圖7 不同激發(fā)、發(fā)射波長下CDs的3D熒光光譜圖。

3.3 CDs的穩(wěn)定性

3.3.1 pH的影響

CDs的熒光強度一定程度上受溶液酸堿度影響，可通過調節(jié)pH值來確定I466/I676對溶液酸堿度的敏感程度，由圖8可知pH的變化對CDs的熒光強度影響不大。CDs的pH效應可能是由于碳點上同時存在—COOH和酰胺，中性和酸性條件下分子間有氫鍵締合作用，碳點聚集導致熒光猝滅[23]。在pH=11時，由于羧基發(fā)生去質子化反應帶上負電荷，使碳點間保持單分散而熒光強度增大。

圖8 不同pH值對CDs熒光強度的影響

3.3.2 抗光漂白性

410 nm紫外燈照射不同的時間測定CDs的發(fā)射熒光強度如圖9所示，從圖中可以看出CDs在466 nm處的發(fā)射峰熒光強度基本不發(fā)生變化，而在676 nm處熒光強度稍有降低，可能原因是酰胺受熱易發(fā)生水解。將4 ℃保存的該CDs每隔15 d測其熒光強度，如圖10 所示。同時，在37 ℃

圖9 410 nm紫外燈照射時間對CDs熒光強度的影響

圖10 不同存儲時間對CDs熒光強度的影響(4 ℃)

下保存，每隔1 d測其熒光強度，如圖11 所示。熒光強度均基本保持不變，表明CDs具有良好的抗光漂白性、優(yōu)秀的光學穩(wěn)定性，這些性質均有利于CDs在細胞成像、靶向示蹤等生化分析方面的應用。

圖11 不同存儲時間對CDs熒光強度的影響(37 ℃)

3.3.3 CDs的抗鹽性

為考察CDs受共存分子和離子的干擾情況，在pH=4的條件下分別加入不同濃度的NaCl、KCl測定 466 nm和 676 nm 處的熒光值。實驗結果表明，I466/I676(如圖12(a)、(b))幾乎不發(fā)生改變，有利于碳點在生物傳感、細胞成像方面的應用。

圖12 不同濃度的KCl/NaCl對CDs熒光強度的影響(NaCl濃度分別為0，0.25，0.5，0.75，1.25，2，2.5 mol/L；KCl濃度分別為0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5 mol/L)

3.4 細胞毒性與活細胞熒光成像

為了探討CDs的生物應用，本文進行了細胞毒性實驗，利用T24細胞株，通過CCK-8分析法測定了CDs的細胞毒性。如圖13所示，該碳納米

圖13 T24細胞與不同濃度CDs孵育24 h后的相對細胞活性

材料的濃度從100 μg/mL增加到500 μg/mL時，細胞的存活率從99%降低到92%，在很寬的濃度范圍內細胞毒性均保持在90%以上，證明該CDs的細胞毒性很低并且具有良好的生物相容性，說明在活細胞成像領域具有巨大的應用潛力。這些也表明制備的CDs可以安全地應用于細胞實驗。

采用激光共聚焦顯微成像技術，比率熒光檢測活細胞成像，在 405 nm激發(fā)波長下，可以在藍光通道中看到細胞膜、細胞質中發(fā)出藍色熒光，在紅光通道中看到細胞膜、細胞質中有紅色熒光(圖14)，表明該 CDs 生物相容性好，對細胞、組織穿透能力強，可有效避免生物體內的背景干擾。

圖14 CDs 和 T24 細胞共同孵育10 h后的CLSM成像圖。(a)藍光通道;(b)明場;(c)紅光通道;(d)疊加圖。

4 結 論

本文以綠色高山榕樹葉為原料，通過溶劑熱法一步合成單激發(fā)雙發(fā)射的近紅外碳基熒光納米傳感器。其優(yōu)勢在于：(1)以天然生物質為原料，綠色環(huán)保、原料廉價易得、生物毒性低；(2)合成純化步驟簡單；(3)熒光量子產率高、發(fā)出近紅外熒光；(4)該碳點具有良好的水溶性、抗鹽、抗光漂白性；(5)生物相容性好，能有效避免生物體內背景干擾。以上結果表明，所得CDs作為環(huán)境友好材料在生物傳感、光學成像等領域具有廣泛的應用前景。

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