譚亞男，尹宗寧

（1. 四川省食品檢驗研究院，四川 成都 611731；2. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院 靶向藥物與釋藥系統(tǒng)教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

鹵泛群[1-2]（halofantrine，HF）是菲甲醇的衍生物，分子式為C26H30Cl2F3NO，1988年5月在法國首次獲準(zhǔn)上市，主要用于治療惡性瘧和間日瘧。已上市口服制劑一般為鹵泛群的鹽酸鹽，水溶性差，生物利用度低，屬于生物藥劑學(xué)分類（BCS）中第II類藥物，其次鹵泛群的lgP值為8.716，脂溶性良好，符合自微乳給藥系統(tǒng)（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）模型藥物的要求。

SMEDDS是由表面活性劑、助表面活性劑、油相形成的固體或液體載藥體系[3-4]。主要優(yōu)點在于：將藥物分散在微米級別的乳滴中，提高藥物溶解度和溶出速率，促進藥物吸收，減少最低給藥量，降低副作用；不改變藥物的分子形態(tài)，保持原有構(gòu)型，避免了可能出現(xiàn)的晶型改變；藥物被包裹在O/W型微乳內(nèi)相的油相中，避免與水相接觸，增強藥物的穩(wěn)定性。自微乳的輔料也能間接起到抑制胃腸道酶代謝及藥物外排的作用，如吐溫-80具有抑制P-糖蛋白（P-gp）外排的作用[5]。本研究以清醒的二插管大鼠為動物模型，建立了高效液相色譜（HPLC）檢測淋巴中HF的方法，測定不同比例處方的生物利用度，以為HF口服制劑的開發(fā)提供研究思路與基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司） ；Nicomp 380 ZLS Zeta電位/粒度分析儀（美國PSS粒度儀公司）；QT-1旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸鹵泛群（HFT，武漢恩宇生物科技有限公司）；亞油酸乙酯（江蘇奧奇海洋生物有限公司）；非諾貝特（FB，徐州恩華藥業(yè)股份有限公司）；辛伐他?。⊿V，上海市食品藥品檢驗所）；花生油（美國Sigma-Aldrich公司）；吐溫80（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（HPLC級，美國Tedia公司）；乙腈（HPLC級，美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性（體重280～320 g），購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹵泛群（HF）的制備

稱取約2 g HFT，依次加入100 ml無水乙醇，0.25 g氫氧化鈉，100 ml水及50 ml二氯甲烷，振搖2 min后靜置分層，收集下層液體。上層液體再用25 ml二氯甲烷萃取一次，合并兩次萃取得到的下層溶液。加入過量無水硫酸鎂干燥，放置過夜。溶液經(jīng)濾紙過濾后旋蒸至干，瓶中油狀物即為HF。

2.2 鹵泛群自微乳化給藥系統(tǒng)（HF-SMEDDS）的制備

根據(jù)文獻[6-7]和前期研究基礎(chǔ)，選擇亞油酸乙酯為油相，吐溫80為乳化劑，無水乙醇為助乳化劑，制備HF-SMEDDS。由于HF較黏稠稱量不便，可將HF定量加入吐溫80中，超聲溶解，得到便于稱量和計算的含藥吐溫80。依次稱取相應(yīng)重量的亞油酸乙酯、乙醇和吐溫80（由含藥吐溫80和空白吐溫80兩部分組成，含藥吐溫80質(zhì)量相同，根據(jù)處方不同，稱取相應(yīng)空白吐溫80）。渦旋混合均勻后，得到淡黃色澄清油狀液體，即得HF-SMEDDS，避光密封備用。

2.3 HF-SMEDDS處方設(shè)計

為考察油相和混合乳化劑（吐溫80和無水乙醇）的比例（A）及乳化劑與助乳化劑的比例（B）對HF淋巴轉(zhuǎn)運的影響，依據(jù)星點設(shè)計原則[8]，設(shè)計了B值為1:1～2:1，A值為2/8（0.25）～4/6（0.667），極值為3:7的9個處方。表1為二因素的星點設(shè)計因素及水平表。按星點設(shè)計效應(yīng)面優(yōu)化得到9個處方，具體成分組成見表 2。

表1 因素及水平

2.4 HF-SMEDDS處方粒徑測定

吸取HF-SMEDDS樣品10 μl于離心管中，加入1～5 ml不等的超純水使其自微乳化，用NICOMP 380 ZLS Zeta電位/粒度分析儀測定粒徑，結(jié)果見表2。

表2 處方設(shè)計及制得HF-SMEDDS粒徑

2.5 HF-SMEDDS中HF含量測定

精確稱取HF-SMEDDS 0.1 g，按中國藥典2020年版溶出度測定中第三法小杯法[9]的有關(guān)操作說明，將HF-SMEDDS裝入普通膠囊中，每個處方平行操作3次，考察其體外釋藥情況。取樣時間點分別為5，10，15，30，45 min。樣品加入過量甲醇破乳，采用HPLC測定HF含量。色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm），加Alltech 充填式預(yù)柱（1.0 mm×20 mm）；流動相為乙腈-水（含 0.2 %十二烷基硫酸鈉和0.2 %冰醋酸）（80:20）；檢測波長：258 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl。該條件下，HF的線性回歸方程為A=1.4950C-0.2124，r=0.9972，在25～5000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。低、中、高3個濃度（1，25，100 μg/ml）的平均回收率分別為93.00 %，98.24 %，97.32 %，精密度RSD分別為2.60 %，1.88 %，2.89 %（n=3），符合樣品分析要求。

2.6 清醒二插管大鼠模型的建立

2.6.1 頸靜脈插管[10]SD大鼠經(jīng)腹腔注射2 %戊巴比妥鈉溶液（0.24 ml/100 g）麻醉，剃去頸部毛發(fā)，剪開約2 cm皮膚，依次鈍性分離肌肉和脂肪組織，分離頸靜脈，將兩根手術(shù)線穿過血管，先結(jié)扎遠心端處血管，防止血液回流，再將血管近心端手術(shù)線打一活結(jié)，在兩根手術(shù)線間的血管段剪小口，插入靜脈管至右心房時，系上近心端預(yù)留的活結(jié)，固定插管。注入生理鹽水，將插管內(nèi)殘余的血液推回心房，防止血液凝固。在大鼠頸后皮膚開口，插入引導(dǎo)管，經(jīng)皮至鎖骨處與靜脈插管聯(lián)結(jié)。

2.6.2 淋巴插管[11]術(shù)前30 min，大鼠灌胃花生油2 ml，使淋巴管充盈，淋巴液由透明變?yōu)槿榘咨Ｂ樽泶笫蠛?，剃去腹部體毛，剪開腹部淋巴總管對應(yīng)處皮膚。用手術(shù)鑷穿引形成皮下通道，將淋巴插管通過2.6.1項所述大鼠頸后皮膚開口經(jīng)皮下至腹部皮膚開口，可使淋巴插管埋入大鼠皮膚固定，繼續(xù)剪開腹部肌肉，挪動內(nèi)臟，暴露乳白色腸系膜淋巴總管。在淋巴總管上剪開小口，插入淋巴插管，在剪口處用醫(yī)用生物膠封閉并固定，縫合傷口，淋巴插管尾端部分插入大鼠背負的玻璃小瓶中，收集淋巴液。

2.6.3 術(shù)后護理 將淋巴插管與頸靜脈插管連接，淋巴液可通過頸靜脈重新進入體液循環(huán)。大鼠清醒后可恢復(fù)行動能力，主動飲水、進食。

2.7 給藥方案及生物樣品的采集處理

2.7.1 動物分組及給藥 隨機選取成功建模后的大鼠30只，每個處方組3只，作為受試組，分別灌胃給予表2中9組處方HF-SMEDDS 0.2 g（含HF 4 mg）。給藥后1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，30 h通過頸靜脈插管抽取0.3 ml血液，加入肝素鈉作為抗凝劑，5000 r/min 離心10 min，取血漿待檢測。同時間點收集大鼠背部玻璃小瓶內(nèi)所有的淋巴液，加入適量抗凝劑混勻，作為淋巴樣品待檢測。3只作為參比組，通過頸靜脈插管給予含HF脂肪乳（將HF加入20 ml脂肪乳注射液）0.3 ml。參比組給藥后5，10，20，60 min及2，4，6，8，10，24，30 h通過頸靜脈插管抽取血樣。

2.7.2 淋巴樣品預(yù)處理及方法學(xué)考察 取淋巴液100 μl，置入10 ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)50 μl，乙腈5 ml，渦旋10 min，靜置，12 000 r/min離心10 min，取上清20 μl，按2.5項下色譜條件進樣分析。HF的淋巴樣品線性回歸方程為：A=0.0187C+0.0014，r=0.9999，在2～250 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法的定量限為25 ng/ml，檢測限為10 ng/ml。方法回收率>98 %，日內(nèi)、日間精密度（n=3）RSD分別為2.05 %，2.31 %，符合要求。

2.7.3 淋巴轉(zhuǎn)運結(jié)果 按2.7.2項下方法處理淋巴樣品，根據(jù)測得的HF濃度，結(jié)合相應(yīng)時間段收集的淋巴液量，計算得到HF淋巴轉(zhuǎn)運累積量占口服給藥量的百分比值，結(jié)果見圖1。各處方HF的淋巴轉(zhuǎn)運基本在12 h內(nèi)完成。處方8轉(zhuǎn)運比例最高（19.64 %），處方1最低（2.25 %）。

圖1 各處方淋巴轉(zhuǎn)運累積百分比

2.7.4 血液樣品預(yù)處理及方法學(xué)考察 取血液樣品100 μl，加入內(nèi)標(biāo)辛伐他?。?0 μg/ml）溶液100 μl及乙腈100 μl，渦旋2 min混勻，12 000 r/min離心10 min。取上層清液轉(zhuǎn)移至C8固相萃取小柱進行分離提取。萃取小柱預(yù)先用2 ml甲醇，2 ml去離子水活化。上清過柱后用1 ml去離子水洗滌2次，再用0.75 ml 15 %甲醇水（v/v）洗滌2次。最后用1 ml 乙醚洗脫兩次，收集洗脫液。40 ℃氮吹至近干，100 μl乙腈復(fù)溶，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清20 μl進樣檢測。血液樣品線性回歸方程為：A=1.059C-113.72，r=0.9968，在31.25～2000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方法的定量限為25 ng/ml，檢測限為10 ng/ml。方法回收率>90 %，日內(nèi)、日間精密度RSD（n=3）分別為1.61 %，2.99 %，符合要求。

2.7.5 各處方HF血液轉(zhuǎn)運結(jié)果及絕對生物利用度 按2.7.4 項下方法，測定9組處方口服給藥后不同時間點血液樣品中HF的濃度，得到HF血液轉(zhuǎn)運量見圖2，其中處方2血樣中未檢測到藥物。

圖2 各處方口服給藥后藥時曲線

按2.7.4項下方法，測定參比組血樣中HF的含量，得到HF靜脈給藥不同時間點的藥時曲線，見圖 3。以參比組靜脈給藥量為對照，計算不同處方口服給藥后的血液中藥物含量與總給藥量的比值，結(jié)果見表4。處方2血藥濃度最低，未達到檢出濃度。處方7血液中藥物量與總給藥量比值最高（13.13 %），其次為處方6（12.67 %）。

圖3 靜脈給藥藥時曲線

表4 口服給藥后血液中藥物含量與總藥量的比值

3 討論

SMEDDS能增加高脂溶性藥物的溶解度，口服后迅速乳化分散，有效提高藥物的吸收速率，同時通過增加藥物的淋巴轉(zhuǎn)運吸收提高藥物的生物利用度。本研究中采用二插管動物模型進行藥動學(xué)實驗，分別測定淋巴液和血液中的藥物含量，可直觀地比較不同處方口服給藥后淋巴轉(zhuǎn)運的差異及生物利用度的不同。

動物模型的建立和生物樣品的凈化是實驗的主要難點。已報道的二插管建模動物包括豬、狗、羊、大鼠等。動物體型越小，動物經(jīng)費成本越低，但手術(shù)操作難度隨之增加。本研究中采用清醒的SD大鼠做為實驗?zāi)Ｐ?，該模型術(shù)后恢復(fù)時間短，不影響動物的自主飲食活動，相較麻醉動物模型，實驗數(shù)據(jù)更貼近正常動物口服給藥后的藥物代謝情況。實驗周期內(nèi)通過頸靜脈插管和腸系膜淋巴插管，可隨時方便地收集血樣和淋巴液樣品。但由于動物存在的個體差異和術(shù)后的恢復(fù)情況不同，所得藥動學(xué)數(shù)據(jù)雖然可反映不同處方間的差異，但平行性較差，后續(xù)研究可通過增加實驗個體數(shù)量改善這一問題。

通過腸系膜插管收集的淋巴樣品，呈乳糜狀，含大量的脂肪和蛋白質(zhì)，雜質(zhì)較少，乙腈提取操作中需注意渦旋提取的時間，我們比較了1，3，5，10 min不同時間的提取效率，發(fā)現(xiàn)渦旋10 min可提取完全。

血液樣品藥物濃度低，雜質(zhì)多。根據(jù)藥物的lgP值大小選擇了C8固相萃取小柱，能有效完成對藥物的富集和提取。

9組處方粒徑范圍從20～336 nm不等，包含了微乳劑和乳劑。粒徑最小的微乳劑淋巴轉(zhuǎn)運量最高，粒徑最大的微乳劑淋巴轉(zhuǎn)運量相對較低，但并非最低。分析實驗結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)微乳劑粒徑大小與藥物淋巴轉(zhuǎn)運量有一定的聯(lián)系?？赡芎退幬镂諘r酶解過程有關(guān)，粒徑小的相對更易被酶解成脂肪酸和甘油單酯，更易于淋巴吸收。但僅從粒徑大小無法完全預(yù)測淋巴轉(zhuǎn)運量的高低。這表明還有其他因素共同影響藥物淋巴吸收的環(huán)節(jié)，或者粒徑的影響作用只在一定的范圍內(nèi)表現(xiàn)明顯。

脂溶性藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運是其口服吸收的重要途徑，本研究中微乳制劑處方的淋巴轉(zhuǎn)運藥物累積量最高可達給藥劑量的19.6 %，對比最少的淋巴轉(zhuǎn)運累積量只有2.2 %，說明通過改進制劑處方增加HF的淋巴轉(zhuǎn)運量可有效提高藥物生物利用度，為HF口服制劑研發(fā)提供了一定研究思路與基礎(chǔ)。