鄧志鵬，柳 佳，熊 山，韓利文

（山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062）

桑辛素（morusin，5, 2’, 4’-三羥基黃酮），又稱(chēng)桑黃素，存在于桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥根皮、樹(shù)枝及桑葚中[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究證明，桑辛素具有抗腫瘤[3-6]、抗菌[7]、抗炎[8]等藥理活性。桑辛素屬異戊烯基黃酮類(lèi)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)證明，黃酮類(lèi)化合物具有較為顯著的藥效，但因該類(lèi)化合物在體內(nèi)可發(fā)生廣泛的I相和II相代謝反應(yīng)，導(dǎo)致其生物利用度較低[9-10]。因此，研宄該類(lèi)化合物在體內(nèi)的吸收及代謝過(guò)程對(duì)其藥物開(kāi)發(fā)有重要影響。目前桑辛素的體內(nèi)代謝過(guò)程研究較少，亟需進(jìn)一步研究。

圖1 桑辛素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與儀器

1.1 儀器

Thermo Scientific超高壓液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher）；EL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sorvall Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)賽默飛世爾）；IKA Vortex天才3旋渦混勻器（廣州艾卡）；氮吹儀（青島聚創(chuàng)環(huán)保）。

1.2 藥品與試劑

桑辛素對(duì)照品（批號(hào)：HM05275198，經(jīng)HPLC 測(cè)定其純度99.48 %，寶雞辰光）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；甲醇，乙腈，乙酸銨為色譜純級(jí)別；水為純凈水，其余試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體重為200±20 g，由濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育公司提供，許可證號(hào)為SCXK（魯）20140007。實(shí)驗(yàn)期間大鼠在恒定環(huán)境下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度為55 %±15 %，飼養(yǎng)溫度為23±3 ℃，日溫差≤4 ℃，晝夜明暗交替時(shí)間10 h/14 h，并可自由飲食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 桑辛素混懸液的配制

稱(chēng)取桑辛素粉末適量，置于10 ml量瓶中，加入適量0.5 %CMC-Na溶解，定容，配制成20 mg/ml桑辛素混懸液，臨用前配制。

2.2 色譜條件

Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：5 mmol/L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2.0 min，10 % B；2.0～20 min，10 %B→95 %B；20～27 min，95 %B；27～27.1 min，95 %B→10 %B；27.1～30 min，10 %B；流速0.6 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子化源（ESI），負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1200；噴霧電壓：3500 V，離子傳輸管溫度：320 ℃，鞘氣壓力：45 arb；輔助氣壓力：10 arb。

2.4 樣品采集

將4只SD大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組 2只，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。給藥組大鼠按20 mg/kg灌胃給予桑辛混懸液，置于代謝籠中，給藥后2，4，8 h分別對(duì)各組進(jìn)行眼眶取血，置于含肝素鈉的EP管中， 4 ℃下、10 000 r/min離心5 min，取上層清液，放入-80 ℃冰箱備用?？瞻捉M大鼠灌胃等體積0.5 % CMC-Na溶液。將4只SD大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，給藥組大鼠按20 mg/kg灌胃給予桑辛混懸液，空白組大鼠灌胃給予等體積0.5 %CMC-Na溶液，置于代謝籠中，給藥后分別收集0～6 h、6～12 h、12～24 h的尿液和0～12 h、12～24 h的糞便，放入-80 ℃冰箱保存。

2.5 樣品制備方法

分別取大鼠給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)（段）的血漿、尿液、糞便樣品，按AUC混合法（AUCpooling）原則進(jìn)行樣本混合。血漿：加3倍量甲醇，渦旋混合5 min后，13 000 r/min離心3 min，取上清。尿液：經(jīng)15 000 r/min離心20 min后，取其上清。糞便：干燥后研磨成粉末狀，稱(chēng)取100 mg，加入1 ml甲醇超聲提取20 min，15 000 r/min離心10 min，取全部上清吹干后，加入流動(dòng)相渦旋混合2 min，取上清，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取 5 μl 進(jìn)樣分析。

2.6 對(duì)照品質(zhì)譜分析

低碰撞能量質(zhì)譜中，主要檢測(cè)到桑辛素的[M-H]-離子（m/z419.1500），其保留時(shí)間為20.14 min。高碰撞能量質(zhì)譜圖中，主要碎片離子為m/z297.11，191.07，109.03，推測(cè)其可能的斷裂途徑見(jiàn)圖2。

圖2 桑辛素的主要裂解途徑

2.7 含藥樣品超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）分析

利用Q-Exactive plus orbitrap質(zhì)譜儀自帶的Compound Discoverer 3.0.0.294軟件，根據(jù)樣品的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，并與相應(yīng)的空白樣品對(duì)比尋找潛在的代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示大鼠灌胃給予桑辛素后，血漿中出現(xiàn)了4個(gè)主要的色譜峰。通過(guò)代謝物鑒定軟件Compound Discoverer 3.0.0.294及Xcalibur數(shù)據(jù)采集功能，對(duì)上述 4個(gè)色譜峰進(jìn)行定性分析，確證為原形M0和3個(gè)代謝產(chǎn)物M1，M2-1和M3[11-12]。尿液中出現(xiàn)了2個(gè)主要的色譜峰，通過(guò)代謝物鑒定軟件及Xcalibur數(shù)據(jù)采集功能，對(duì)上述 2個(gè)色譜峰進(jìn)行定性分析，確證為2個(gè)代謝產(chǎn)物M2-1和M3；糞便中出現(xiàn)了7個(gè)主要的色譜峰。通過(guò)代謝物鑒定軟件及Xcalibur數(shù)據(jù)采集功能，對(duì)上述 7個(gè)色譜峰進(jìn)行定性分析，確證為原形M0和6個(gè)代謝產(chǎn)物M1，M2-1～M2-3，M4和M5。見(jiàn)圖3、表1。

表1 桑辛素的大鼠血漿、尿液和糞便推測(cè)代謝產(chǎn)物

圖3 大鼠體內(nèi)桑辛素代謝物的離子流色譜圖

M1：保留時(shí)間為 16.36 min，m/z435.1449，比M0（m/z419.1500）多16，主要碎片離子m/z313.11，比原形桑辛素的子離子碎片（m/z297.11）多16。因此推測(cè)M1為羥基化代謝產(chǎn)物。

M2-1～M2-3：保留時(shí)間分別為13.09，10.41和1 3.4 3 m i n，m/z5 9 5.1 8 2 1，比M 0（m/z419.1500）多176，推測(cè)可能為葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生特異性子離子m/z419.15，推測(cè)為葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物脫去1分子葡萄糖醛酸產(chǎn)生碎片離子，此外3個(gè)代謝產(chǎn)物的子離子m/z297.11，與原形桑辛素的子離子一致，因此推測(cè)M2-1～M2-3為桑辛素的3個(gè)葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，葡萄糖醛酸化發(fā)生在3個(gè)羥基化位置，生成了3個(gè)同分異構(gòu)體。

M3：保留時(shí)間為11.15 min，m/z611.1770，比M0（m/z419.1500）多192（16+176），主要碎片離子m/z435.15，與M1一致。因此推測(cè)M3為桑辛素的羥基化加葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。

M4：保留時(shí)間為 12.81 min，m/z451.1398，比M0（m/z419.1500）多32，主要碎片離子m/z329.10，比原形桑辛素的子離子碎片（m/z297.11）多32。因此推測(cè)M4為雙羥基化代謝產(chǎn)物。

M5：保留時(shí)間為11.33 min，m/z517.1174，比M0（m/z419.1500）多98（2+16+80），主要碎片離子m/z435.15，與M1一致。因此推測(cè)M5為桑辛素的加氫還原加羥基化加硫酸化反應(yīng)產(chǎn)物。

3 討論

HRMS技術(shù)顯著提高代謝物鑒定的準(zhǔn)確度和分析通量，在天然活性成分代謝產(chǎn)物鑒定研究中起到不可替代的作用[13]。本課題組前期研究報(bào)道[14-15]，大鼠灌胃給予桑辛素和桑白皮提取物后，采用液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜評(píng)價(jià)了原形桑辛素在正常大鼠和糖尿病模型大鼠中的血漿藥動(dòng)學(xué)。目前對(duì)桑辛素的體內(nèi)代謝研究很少。由于桑辛素分子結(jié)構(gòu)中含3個(gè)酚羥基基團(tuán), 在負(fù)離子ESI模式下, 桑辛素易形成脫氫離子[M-H]-，其m/z419.15。本研究采用負(fù)離子模式鑒定桑辛素的代謝產(chǎn)物，采用UPLC-Q-Exactive plus orbitrap-MS技術(shù)，對(duì)桑辛素灌胃20 mg/kg后在大鼠血、尿、糞中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析及鑒定。分析各代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖，通過(guò)與原形藥物二級(jí)質(zhì)譜圖及質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行比較，結(jié)合Compound Discoverer 3.0.0.294軟件進(jìn)行分子式的擬合，共鑒定了除原形藥物之外的7個(gè)代謝產(chǎn)物，其中包括代謝物M2的3個(gè)同分異構(gòu)體（M2-1～M2-3）。從代謝物的結(jié)構(gòu)來(lái)看，原形藥物在體內(nèi)主要發(fā)生了羥基化和葡萄糖醛酸化等反應(yīng)，其中代謝產(chǎn)物M2出現(xiàn)的同分異構(gòu)體，可能是原形藥物本身結(jié)構(gòu)的原因，也可能是由于發(fā)生代謝反應(yīng)時(shí)反應(yīng)的位點(diǎn)不同。具體為血漿和糞便中除原形化合物外，還有羥基化產(chǎn)物和葡萄糖醛酸結(jié)合物。尿中未檢出原形化合物，主要代謝物為原形的葡萄糖醛酸結(jié)合物（M2-1）和原形的羥基化+葡萄醛酸結(jié)合物（M3）。