任春光，蘇文文，潘麗珊，韓振誠，吳 迪，李良良，王加國，李葦潔*

基于高通量測序研究獼猴桃苗不同生育期根際真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性①

任春光1，蘇文文1，潘麗珊2，韓振誠1，吳 迪1，李良良1，王加國1，李葦潔1*

(1 貴州省山地資源研究所，貴陽 550001；2貴州大學林學院，貴陽 550025)

為探究獼猴桃苗不同生長期與根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性及土壤養(yǎng)分之間的相互關(guān)系，利用Illumina MiSeq高通量測序研究獼猴桃苗3個不同生長階段(生長前期、速生期、生長后期)根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性，運用 CANOCO和R語言軟件對土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子間關(guān)系進行RDA和相關(guān)性分析。結(jié)果表明：獼猴桃苗不同生長期土壤性質(zhì)均存在顯著差異，隨著獼猴桃苗根系不斷生長，土壤pH、速效氮、有效磷出現(xiàn)先升高后降低趨勢，速效鉀則出現(xiàn)先降低后升高；高通量測序共得到1 776個真菌OTUs，分屬于10門22綱151科157屬；方差分析表明各生長時期多樣性指數(shù)(Shannon)差異顯著；序列分析發(fā)現(xiàn)，子囊菌門(Ascomycota，豐度72.69%)、被孢霉門(Mortierellomycota，18.80%)、羅茲菌門(Rozellomycota，6.68%)、擔子菌門(Basidiomycota，4.28%)和球囊菌門(Glomeromycota，1.45%)是獼猴桃苗不同生長期的優(yōu)勢菌門(豐度大于1% 的視為優(yōu)勢菌門)；對不同生長時期優(yōu)勢菌門所占比例進行分析，發(fā)現(xiàn)子囊菌門出現(xiàn)先升高后降低，被孢霉門、羅茲菌門和擔子菌門則出現(xiàn)先降低后升高，球囊菌門相對豐度隨著獼猴桃根系生長逐漸升高；RDA分析結(jié)果顯示，有效磷和pH與子囊菌門顯著正相關(guān)，速效鉀與子囊菌門顯著負相關(guān)，有機碳與壺菌門(Chytridiomycota)顯著負相關(guān)。綜上，獼猴桃苗在不同生長時期根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)不同，速生期根際真菌種群最豐富，生長后期最少；子囊菌門、被孢霉門、羅茲菌門和擔子菌門始終是獼猴桃苗生長期根際優(yōu)勢菌群；根際真菌群落組成和土壤養(yǎng)分變化受獼猴桃苗不同生長時期的影響，其中土壤有效磷和速效鉀是影響子囊菌門群落組成的重要因子。

獼猴桃；根際群落多樣性；土壤環(huán)境因子；相關(guān)性分析

植物健康的生長發(fā)育離不開根際微生物菌群的協(xié)同作用，而土壤中微生物菌群也依賴植物根系獲取營養(yǎng)物質(zhì)以維持自身的繁殖和生存。根際微生物的多樣性及其豐富度與植物健康密切聯(lián)系，同時根際微生物是衡量土壤肥力的指標之一[1]。植物生長發(fā)育與根際區(qū)微生物的關(guān)系非常密切，根際區(qū)是植物根系與土壤養(yǎng)分、能量交換的場所。大量研究表明，根際微生物菌群多樣性和豐富度受植物類型、土壤類型、土壤pH等諸多因素影響[2-3]。即使同一植物的不同基因型和相同作物的不同生長時期，其根際微生物的數(shù)量、種類和多樣性也呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢，植物的發(fā)育階段在決定菌群結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵作用[4-5]。因此，研究根際微生物對植株生長的影響成為科學家研究的新熱點。

獼猴桃是獼猴桃科獼猴桃屬藤本落葉果樹，其果實細嫩多汁、清香鮮美、酸甜宜人，營養(yǎng)極為豐富，素有“果中珍品”的美譽。獼猴桃產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中具有重要的地位。因美味獼猴桃為種子繁殖，出苗率高，該品種培育的砧木生長旺盛、抗病性強，具有發(fā)達的根系，能夠有效吸收土壤中的養(yǎng)分，而且與紅陽和東紅獼猴桃嫁接親和力好，嫁接樹結(jié)果早、產(chǎn)量高[6]。因此，生產(chǎn)上將美味獼猴桃種子繁殖的實生苗作為獼猴桃的砧木，目前該砧木在貴州和四川應(yīng)用較多。而獼猴桃砧木苗質(zhì)量的好壞直接影響獼猴桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，培育健壯的獼猴桃砧木，是保障獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要保障。

大量研究證明，土壤中的真菌能分泌植物生長調(diào)節(jié)劑，如促生激素和揮發(fā)性有機化合物，能促進植物生長，部分有益微生物能增強植物的抗病性、保水能力和抗旱耐鹽等能力[7]。此外，也有研究者對果蔬類根際微生物展開了相關(guān)研究，例如仝利紅等[8]、王飛等[9]分別研究了草莓和黑果枸杞作物中土壤群落的多樣性和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)微生物數(shù)量和多樣性與植物不同生育期和根際養(yǎng)分密切相關(guān)。因此，研究獼猴桃苗不同生長期與根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系，對生產(chǎn)中通過改變土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，從而培育健壯的苗木具有重要意義。目前關(guān)于獼猴桃苗不同生長時期根際真菌群落結(jié)構(gòu)變化研究較少。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對獼猴桃苗不同生長期根際土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，探討獼猴桃苗不同生長期與真菌群落組成及土壤養(yǎng)分之間的相互關(guān)系，詳盡反映獼猴桃苗生長過程中根際環(huán)境的變化，為在實踐中改良苗圃地微生物種群和土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)，培育健壯苗木提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省水城縣米籮鎮(zhèn)俄嘎村獼猴桃產(chǎn)學研基地，地理坐標104°58′01.39″ ～ 26°24′57.81″E， 26°24′53″ ～ 26°25′05″N，海拔1 000 ～ 1 200 m，年均日照時數(shù)1 560 h，年均有效積溫4 500 ℃，年均氣溫17.8 ℃，土壤類型為壤土，年降水量為1 100 ～ 1 350 mm。

1.2 樣地設(shè)置及土壤采集

獼猴桃種子為貴長獼猴桃(cv. Guichang)，獼猴桃育苗圃共3個，作為樣地生物學重復(fù)，育苗圃規(guī)格均為長方形(長×寬=1.5 m × 0.8 m)，于2019年3月播種，分別于2019年6月(獼猴桃苗株高7 ～ 8 cm，主莖直徑0.1 ～ 0.2 cm)、8月(獼猴桃苗株高16 ～ 17 cm，主莖直徑0.5 ～ 0.6 cm)和10月(獼猴桃苗株高19 ～ 20 cm，主莖直徑0.6 ～ 0.7 cm)采用隨機5點混合取樣法，分別采集獼猴桃苗生長前期根際土壤(標記mc1、mc2、mc3)、速生期根際土壤(標記mz1、mz2、mz3)、生長后期根際土壤(標記mh1、mh2、mh3)樣品，且從播種到最后一次采樣結(jié)束均未施用任何肥料。根際土壤取樣參考楊美玲等[2]“抖落法”。土壤樣品采集完后充分混合裝入無菌自封袋，并低溫帶回實驗室分別放在4 ℃ 和?80 ℃ 冰箱保存，分別用于土壤養(yǎng)分含量測定和高通量測序。

1.3 土壤理化指標

取200 g土壤在35 ℃ 烘箱烘干后用于以下指標分析：土壤理化指標檢測參考鮑士旦主編的《土壤農(nóng)化分析》。土壤pH在采樣時，采用便捷式酸度計測定，土壤速效氮(AN)采用堿解擴散法測定，土壤有效磷(AP)采用NaHCO3浸提–鉬銻比色法測定，土壤速效鉀(AK)采用醋酸銨浸提–火焰原子光度計法測定，土壤有機碳(SOC)采用重鉻酸鉀分光光度法測定，每個指標設(shè)置3個重復(fù)，使用SPSS(Version 18.0)分析軟件對土壤理化性質(zhì)進行單因素方差分析。

1.4 土壤真菌分子測序

每個樣品總DNA基因組采用CTAB法進行提取，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA，每個樣品3個重復(fù)。以稀釋后的DNA為模板，使用高保真酶進行PCR擴增，擴增引物序列分別是：ITS1 F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2 R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR 擴增反應(yīng)體系(20 μl)：DNA模板3 μl，5×FastPfu Buffer 4 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl, Forward Primer(5 μmol/L) 0.8 μl，Reverse Primer (5 μmol/L)) 0.8 μl，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μl，BSA 0.2 μl，ddH2O28.8 μl。PCR 反應(yīng)條件：97 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min。PCR 產(chǎn)物使用2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Thermo Scientific公司提供的膠回收試劑盒進行回收純化。經(jīng)檢測合格的PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司用于 Illumina MiSeq上機測序。

1.5 生物信息及統(tǒng)計分析

使用軟件FLASH對MiSeq測序得到的雙端序列根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。采用Usearch軟件平臺(vsesion 7.0 http:// drive5.com/uparse/)對全部有效序列進行聚類，將達到97% 以上的序列聚類為OTUs，使用RDP classifier (version 2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)貝葉斯算法對97% 相似水平的OTU代表序列進行分類，并分別在界(kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)統(tǒng)計各樣本的群落物種組成，比對真菌ITS Unit數(shù)據(jù)庫(https://unite.ut.ee/)分類注釋土壤真菌物種信息。最后利用Mothur軟件分析，計算不同隨機抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)，通過Alpha多樣性分析可以得到群落中物種的豐富度、覆蓋度和多樣性等。用97% 相似性的樣本OUT，基于spearman相關(guān)系數(shù)，采用R語言分析環(huán)境因子與樣本群落做RDA和Heatmap相關(guān)分析并作圖。運用SPSS(Version 18.0)軟件進行單因素方差(One-way Anova)和鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan)做差異顯著統(tǒng)計比較分析。測序與信息分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃苗不同生長期根際土壤理化性質(zhì)

由表1可知，隨著獼猴桃苗根系不斷生長，土壤pH、速效氮、有效磷出現(xiàn)先升高后降低趨勢，速效鉀則隨著根系生長呈先降低后升高的趨勢。方差分析顯示，土壤pH、速效氮和有效磷含量表現(xiàn)為速生期與生長前期和生長后期差異顯著(<0.05)；土壤速效鉀則表現(xiàn)為生長前期與速生期和生長后期差異顯著；土壤有機碳在獼猴桃生長各時期無顯著差異。

表1 獼猴桃苗不同生長期根際土壤理化性質(zhì)

注：mc、mz、mh分別表示獼猴桃苗生長前期、速生期和生長后期根際土壤；表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示不同根際土壤間差異達<0.05顯著水平，下表同。

2.2 獼猴桃苗不同生長期根際真菌群落組成和變化規(guī)律

2.2.1 真菌群落豐度與多樣性 由圖1可知，當序列數(shù)在30 000時所有樣品Sobs指數(shù)曲線趨于平緩，說明所有樣品進入平臺期，所有土壤樣品能夠真實反映不同生長時期的真菌群落信息。從表2可知，獼猴桃苗3個不同生長期的9個土壤樣品共獲得215 612條有效序列，平均長度為234.62 bp，以97% 相似水平下對序列進行OTUs聚類，共得到1 776個OUTs，各樣品測序覆蓋率99% 以上(表2)。方差分析發(fā)現(xiàn)，多樣性指數(shù)(Shannon)表現(xiàn)為獼猴桃生長前期與速生期和生長后期之間有顯著差異(<0.05)，Chao1豐富度指數(shù)和覆蓋率在各時期無顯著差異(表2)。分析結(jié)果表明，獼猴桃苗在不同生長階段，根際土壤真菌的豐富程度基本趨于一致，但是多樣性有差異，隨著獼猴桃苗根系生長，多樣性在逐漸減少或趨于平緩。

2.2.2 真菌數(shù)量構(gòu)成及物種分布 9個土壤樣品共獲得1 776個OTUs，分屬于10門22綱151科157屬。各生長時期門水平上的數(shù)量構(gòu)成均是10個門；在綱水平上數(shù)量構(gòu)成體現(xiàn)為生長初期和速生期一樣多，但比生長后期多1個綱；在科和屬水平上數(shù)量構(gòu)成均表現(xiàn)為速生期最多，其次是生長初期，數(shù)量最少的是生長后期(表3)。此結(jié)果表明，獼猴桃苗生長過程中，土壤中真菌科和屬數(shù)量出現(xiàn)先升高后降低趨勢，在獼猴桃苗速生期真菌OTUs數(shù)量高于其他時期，生長后期最少。

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計、豐富度及多樣性

表3 獼猴桃苗不同生長期土壤真菌門、綱、科、屬的數(shù)量構(gòu)成

由表4 可知，在獼猴桃生長初期土壤真菌特有菌屬有43個(已分類屬有29個，未分類的有14個屬，鑒定比例67.44%)；速生期特有菌屬有59個(已分類屬有45個，未分類的有 14 個屬，鑒定比例76.27%)；生長后期特有菌屬有30個(未分類的有 4 個屬，鑒定比例80%)。此外，猴桃苗各生長時期共有的菌屬有170個(未分類的有54屬，鑒定比例68.23%)，其中被孢霉屬(15.84%) 、枝鼻菌屬(7.39%)、鐮刀菌屬(7.06%)、球囊菌(4.55%)、柱孢屬(3.14%) 5個屬相對豐度較大，是獼猴桃苗整個生長期共有的核心真菌(表5)。分析結(jié)果表明獼猴桃苗在不同生長期，這些特有和核心菌群與獼猴桃生長發(fā)育密切相關(guān)。

表4 獼猴桃苗不同生長期土壤真菌特有菌屬構(gòu)成

表5 獼猴桃不同生長期共有菌屬組成

2.2.3 真菌群落組成及變化規(guī)律 1)門分類水平。表6為獼猴桃苗在3個不同生長期根際土壤真菌門分類水平下菌群組成比例及變化規(guī)律(相對豐度<1% 歸為其他)。獼猴桃苗生長期，相對豐度最大是子囊菌門Ascomycota (72.69%)，其次為被孢霉門Mor-tierellomycota (18.80%)，羅茲菌門Rozello-my-cota (6.68%)，擔子菌門Basidiomycota(4.28%)和球囊菌門Glomeromycota(1.45%)。在門分類水平下，有10.62% ～ 17.13% 的真菌類群依據(jù)目前分類學無法劃分到任何菌門水平。子囊菌門相對豐度隨著獼猴桃根系生長表現(xiàn)先升高后降低趨勢，在速生期最高，相對豐度高達72.69%；被孢霉門、羅茲菌門和擔子菌門出現(xiàn)先降低后升高，在生長初期相對豐度最高；球囊菌門相對豐度隨著獼猴桃根系生長逐漸增加。子囊菌門在各生長期相對豐度差異顯著，其他菌門隨著獼猴桃根系生長有變化，但差異不顯著。

表6 門分類水平下的真菌組成

分析結(jié)果表明，子囊菌門、被孢霉門、羅茲菌門、擔子菌門和球囊菌門是獼猴桃苗不同生長期根際土壤微生物組成的核心真菌，其中子囊菌門和被孢霉門占主導(dǎo)地位，根際真菌群落組成變化與不同生長時期密切相關(guān)。

2)科分類水平。表7為獼猴桃苗在3個不同生長期根際土壤真菌科分類水平下個菌群組成比例及變化規(guī)律(相對豐度<1% 歸為其他)。在獼猴桃苗生長期，根際真菌群落相對豐度較高的是毛球殼科Lasiosphaeriaceae(18.97%)，其次為被孢霉科Mortiere-llaceae(17.32%)、叢赤殼科Nectriaceae(13.20%)、白球菌科Pletctosphaerellaceae(6.42%)。部分菌科在不同生長期出現(xiàn)豐度很低或缺少，例如：糞傘科(Bolbitiaceae)在生長初期出現(xiàn)，在速生期和生長后期相對豐度很低；曲霉科(Aspergillaceae)和圓盤菌科(Orbiliaceae)的真菌群落在速生期出現(xiàn)，在生長初期和生長后期相對豐度很低，將相對豐度低的均歸在其他類型。此外有35.52% ～ 26.03% 的真菌類群依據(jù)目前分類學研究無法劃分到任何菌科水平。

表7 科分類水平下的真菌組成

被孢霉科和叢赤殼科相對豐度隨著獼猴桃根系生長表現(xiàn)先降低后升高趨勢，在生長后期豐度最高；毛球殼科、白球菌科、毛殼菌科出現(xiàn)先升高后降低，在速生期豐度最高；葡萄穗霉科相對豐度隨著獼猴桃根系生長表現(xiàn)逐漸降低。在各生長時期，土壤樣品間的相對豐度有糞傘科、曲霉科和亞隔孢殼科存在顯著差異，其他菌群差異不顯著。已有報道，毛殼菌可作為生防菌防控由絲核菌、鐮刀菌引起的松苗猝倒病，還可防控由致病菌引起的蘋果黑星病[10]。本研究發(fā)現(xiàn)毛殼菌在獼猴桃苗速生期最高，因此推測該菌可能在獼猴桃速生期對促進獼猴桃苗健康生長具有積極作用。

分析結(jié)果表明，獼猴桃苗在整個生育期的真菌具有相似性，被孢霉科、毛球殼科、叢赤殼科白球菌科是獼猴桃苗生長期的優(yōu)勢菌科。

3)屬分類水平。表8為獼猴桃苗在3個不同生長期根際土壤真菌屬分類水平下各菌群組成比例及變化規(guī)律(相對豐度<1% 歸為其他)。在獼猴桃苗不同生長期，根際土壤相對豐度最大是被孢霉屬(18.63%)，其次是枝鼻菌屬(16.65%)、鐮刀菌屬(8.02%)。有42.19% ～ 28.75% 的真菌類群依據(jù)目前分類學研究無法劃分到任何菌屬水平。

表8 屬分類水平下真菌組成

被孢霉屬和鐮刀菌屬相對豐度隨著獼猴桃根系生長表現(xiàn)先降低后升高，在生長后期最高；枝鼻菌屬()相對豐度則表現(xiàn)先升高后降低，速生期達最高。大部分菌屬在不同生長期出現(xiàn)豐度較低，例如：枝鼻菌屬()、錐蓋傘屬()和莖點霉屬()相對豐度在生長前期比速生期和生長后期高；節(jié)叢孢屬()和青霉屬()相對豐度在速生期比生長初期和生長后期高；環(huán)腺菌屬()、鐮刀菌屬()和瓶霉菌屬()的相對豐度在生長后期比生長初期和速生期高。還有部分菌屬是獼猴桃不同生長時期的特有菌屬(表4)。

分析結(jié)果表明，在屬分類水平上，不同生長時期的土壤真菌群落組成差異主要體現(xiàn)在被孢霉屬、枝鼻菌屬和鐮刀菌屬，他們是獼猴桃苗不同生長期土壤微生物組成的核心真菌，且占主導(dǎo)地位，根際菌群組成和比例與不同生長時期密切相關(guān)。

2.3 真菌優(yōu)勢群落與土壤特性的關(guān)聯(lián)分析

通過RDA分析得知，第一、二軸分別解釋了51.53% 和11.74%，累計解釋率達到63.27%(圖2)，說明第一、二軸能很好地反映出獼猴桃苗生長期優(yōu)勢真菌群落組成與土壤環(huán)境因子之間的相關(guān)性。其中具有優(yōu)勢的子囊菌門與有效磷、速效氮、pH箭頭方向相同，呈正相關(guān)，與有機碳、速效鉀方向相反，呈負相關(guān)；被孢霉門、擔子菌門與有機碳、速效鉀相同，呈正相關(guān)，與有效磷、速效氮、pH呈負相關(guān)(圖2)。RDA分析結(jié)果表明，土壤中速效養(yǎng)分含量與獼猴桃苗不同生長期真菌變化具有相關(guān)性。

進一步通過spearman相關(guān)性系數(shù)評估土壤中優(yōu)勢真菌與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，將總豐度前12個物種通過相關(guān)性表更詳細和直觀展示真菌群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。從表9可知，子囊菌門與有效磷含量呈極顯著正相關(guān)(spearman相關(guān)系數(shù)=0.80，=0.009)；與pH呈顯著正相關(guān)(= 0.76，= 0.017)；與速效鉀呈極顯著負相關(guān)(=–0.80，=0.009)；與速效氮呈正相關(guān)(= 0.18，=0.65)，與有機碳負相關(guān)(= –0.25，=0.52)，但相關(guān)性不顯著。壺菌門與有機碳呈顯著負相關(guān)(=–0.72，=0.029)，與其他速效養(yǎng)分相關(guān)性不顯著。此外，還有大部分菌門與速效養(yǎng)分有相關(guān)性，但相關(guān)性均不顯著，例如被孢霉門與有機碳(=0.6，=0.087)和速效鉀(=0.47，=0.2)呈正相關(guān)，與速效氮(= –0.15，=0.69)、有效磷(= –0.35，=0.35)和pH(= –0.27，=0.47)呈負相關(guān)。擔子菌門、羅茲菌門、球囊菌門等與速效養(yǎng)分無顯著相關(guān)性(圖2、表9)。

以上分析結(jié)果表明，獼猴桃苗不同生長時期，土壤中不同真菌類群與土壤養(yǎng)分含量的相互關(guān)系存在差異，其中土壤有效磷和速效鉀含量是影響子囊菌門群落組成的主導(dǎo)因子。

表9 真菌優(yōu)勢類群與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性

注：*，**分別表示相關(guān)性達<0.05和<0.01顯著水平。

3 討論

3.1 根際土壤養(yǎng)分變化分析

由表2可知，根際速效氮和有效磷在速生期最高，過了速生期又下降；速效鉀則隨著根系的生長先降低后升高；有機碳幾乎不變。出現(xiàn)這種養(yǎng)分變化可能是根際土壤微生物具有對土壤氮、磷循環(huán)影響的結(jié)果。氮和磷是植物生長兩大必需元素，有研究發(fā)現(xiàn)微生物通過氮礦化、硝化、反硝化等氮循環(huán)過程，在短期會增加土壤有效氮含量[11-12]。例如叢枝菌根真菌能夠改變土壤微生物，進而影響土壤氮礦化，增加土壤有效氮庫存[13]。此外，土壤中的很多真菌具有分解植物殘體和有機質(zhì)中的磷的作用，通過分泌磷酸酶，將有機磷水解為磷酸根和其他無機磷轉(zhuǎn)化為有效磷，增加土壤磷的供應(yīng)[14]，還有研究認為，叢枝菌根還能為植物貢獻高達90% 的磷[15-16]。由此可知，土壤真菌在土壤為植物提供養(yǎng)分過程中起著重要作用。本研究在速生期速效氮和有效磷含量增加，可能是在速生期含有相對豐富的叢枝菌根真菌或其他能快速分解有機質(zhì)的真菌，這些真菌通過土壤氮循環(huán)和土壤磷循環(huán)過程，進而改變土壤根際環(huán)境，以滿足獼猴桃苗速生期營養(yǎng)需求。這一推測與子囊菌和球囊菌(叢枝菌根真菌歸屬于球囊菌門)在速生期豐度較高相呼應(yīng)。因此，生產(chǎn)上可通過間接調(diào)控土壤微生物的功能達到調(diào)控土壤養(yǎng)分的目的。

3.2 根際土壤真菌群落組成及多樣性分析

用土壤微生物生物量、多樣性、微生態(tài)平衡等指標來評價土壤的質(zhì)量和健康程度已被人們認可。Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)作為新一代測序手段，能夠系統(tǒng)全面地測定和分析土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征，常用Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)來評價群落豐度和群落多樣性，其指數(shù)值越高，說明該區(qū)域的群落豐度和多樣性高，目前已在農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域得以迅速應(yīng)用[17]。本研究通過Illumina MiSeq高通量測序研究3個不同生長時期獼猴桃苗根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)子囊菌門隨著獼猴桃根系生長表現(xiàn)先升高后降低，在速生期子囊菌門的比例最高達72.69%。這一點與仝利紅等[8]監(jiān)測結(jié)果基本一致，仝利紅等研究草莓不同生育期根際微生物的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)真菌相對豐度最高的是子囊菌門，且優(yōu)勢菌群的豐富度和多樣性在花期上升，生長后期又下降，主要菌群相對豐度也隨著生育期的變化而變化。與康捷等[18]研究麻山藥不同生長時期主要真菌種類和相對豐度比較既有相似部分，也有差異部分，相似部分：鐮刀菌屬和被孢霉屬都是麻山藥和獼猴桃苗共有的主要真菌屬；差異部分是不同生長時期，主要真菌屬其變化趨勢存在差異，例如：被孢霉屬在麻山藥生長過程中相對豐度逐漸增加，而在獼猴桃苗生長過程中被孢霉屬在速生期最低，到生長后期又開始增加到生長初期的水平，鐮刀菌屬在麻山藥生長后期相對豐度最低，而在獼猴桃生長后期剛好相反。出現(xiàn)這種異同的可能原因是根際土壤菌群組成和優(yōu)勢菌屬具有植物特異性，不同的根際菌群與植物種類、不同發(fā)育階段、土壤理化性質(zhì)等很多因素有關(guān)，但植物的發(fā)育階段在決定菌群結(jié)構(gòu)方面可能起著重要作用，這一結(jié)論與趙柏霞等[19]、Schüβler等[20]研究結(jié)果一致。

叢枝菌根真菌(AMF)與植物根系可形成菌根共生體，促進植物生長。AMF能夠明顯促進土壤中速效養(yǎng)分的吸收和利用。2001年，德國科學家把AMF的分類提升至門，并把AMF命名為球囊菌門[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在獼猴桃苗生長過程，球囊菌門相對豐度逐漸增加，這一趨勢變化與楊鳳鈴等[21]研究煙草栽培過程中AMF變化基本一致，但是與煙草根際速效氮、有效磷和pH變化有差異；與鞏曉芳等[5]研究當歸不同生長時期AMF以及有效磷、速效氮、速效鉀等土壤養(yǎng)分的變化趨勢也有差異。有資料表明球囊菌的代謝物球囊霉素不僅具有重要的碳匯功能，還具有改善土壤質(zhì)地和提高土壤全氮和其他養(yǎng)分含量的作用[22]。由此推測，在獼猴桃生長過程中，檢測到的球囊菌作為叢枝菌根真菌，可促進獼猴桃根系對養(yǎng)分吸收和利用來幫助獼猴桃苗的生長，球囊菌可能在獼猴桃苗生長過程中具有積極的促進作用。

本研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃苗不同生長時期，土壤中真菌Shannon指數(shù)之間有顯著差異，但Chao1豐富度指數(shù)無顯著差異，根際土壤真菌科、屬、總OTUs和特有菌屬數(shù)量在速生期均最高，生長后期最低(表2和表4)。表明獼猴桃苗在速生期根際生理代謝活動最強，根系產(chǎn)生的代謝物可能僅有利于某些特定菌群的生長而成為優(yōu)勢菌群，而這些菌群可能具有競爭優(yōu)勢并大量繁殖，所以出現(xiàn)速生期數(shù)量增加，另一些菌群則在競爭中被抑制或降低，與本試驗中豐度指數(shù)不變、多樣性指數(shù)有差異相呼應(yīng)。早在1954年，Martin 等[23]研究發(fā)現(xiàn)燕麥種子被球毛殼菌侵染后，會使燕麥根際土壤中鐮刀菌相對含量降低或受到抑制，而被球毛殼菌數(shù)量增加。本研究中被孢霉屬相對豐度增加，鐮刀菌屬相對豐度也隨著增加(表8)，這點與Martin等[23]測定結(jié)果有差異。出現(xiàn)這種差異的可能原因是被孢霉屬和鐮刀菌屬其包含的種類太多，由于本研究未檢測到種，大部分只比對到屬，可能存在種與種之間較大的功能差異，所以導(dǎo)致結(jié)果差異。例如，Zhang等[24]報道，發(fā)現(xiàn)非致病尖刀鐮刀菌()在棉花根部產(chǎn)生的烯烴類、烷類、酯類、有機酸等多種揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)具有廣譜的抗真菌活性，對很多致病菌如黃曲霉菌()、灰葡萄孢菌()、禾谷鐮孢菌()、意大利青霉()、立枯絲核菌()等14種真菌具有一定殺菌功能和抗菌活性。另一種尖刀鐮刀菌能引起植物苗期猝倒病，由此可知，鐮刀菌屬不同種之間的功能差異較大。本研究雖然檢測到了相對豐度較高的鐮刀菌，但只是在屬的水平進行比較，本研究中監(jiān)測的鐮刀菌是否存在與Zhang報道尖刀鐮刀菌是相同的種，有待考證。此外還有另外一種觀點認為，土壤中鐮刀菌和絲核菌含量增加是土壤惡化、作物連作障礙的指示真菌[25]。本試驗地塊由于是第一年培育獼猴桃苗，鐮刀菌屬在生長后期相對含量較高，是否表明該試驗地土壤環(huán)境發(fā)生惡化，是否與后期連作障礙有關(guān)，需在后續(xù)試驗中繼續(xù)檢測。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在獼猴桃不同的生長發(fā)育期，根際土壤中均出現(xiàn)一些特有屬，例如：根生壺菌屬()、暗球腔菌屬()等44種菌屬是生長初期特有菌屬；球腔菌屬()、枝霉屬()等60種是速生期特有菌屬；擬青霉屬()、黑耳屬()等30種是生長后期特有菌屬。這些種屬在獼猴桃的生長發(fā)育過程中的功能未知。結(jié)合獼猴桃苗不同生長期對溫度、濕度、土壤養(yǎng)分等環(huán)境的要求，以及根系自身的代謝活動強弱，推測這些特定菌屬的功能可能存在著一個復(fù)雜的調(diào)控機制。然而根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，植物種類、植物生長發(fā)育、土壤環(huán)境因子都是影響根際真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子[17,26]，這些因子通過什么途徑調(diào)控植物生長，以及其影響程度等仍然不清楚，后續(xù)研究可從這些特有菌群和主要菌群著手，探究獼猴桃苗不同生長時期這些特有菌屬在獼猴桃根際中的功能，可通過研發(fā)土壤微生物菌劑的措施，改變土壤微生物菌群的結(jié)構(gòu)，使其通過真菌與真菌之間的相互作用，達到抑制有害菌的生長，增加有益菌繁殖，為后續(xù)培育健康的獼猴桃苗木提供一定的參考。

3.3 根際真菌群落與土壤養(yǎng)分關(guān)系分析

土壤酸堿性、速效氮、有效磷、速效鉀、有機碳等均屬于土壤養(yǎng)分的基本組成成分，可以反映出土壤的肥力狀況，它們對土壤中微生物的繁殖、生存和植物的生長具有顯著影響。土壤真菌群落與土壤理化因子的相關(guān)性表明，獼猴桃苗不同生長時期有效磷和土壤pH與子囊菌顯著正相關(guān)，速效鉀與子囊菌顯著負相關(guān)，但與其他菌群相關(guān)性不顯著。說明有效磷、速效鉀、pH是影響子囊菌門物種組成和豐度的主要因子，在偏酸性土壤中子囊菌容易富集和繁殖。該研究結(jié)果與趙帆等[27]研究草莓根際菌群結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分有差異，如在草莓根際土壤中，子囊菌門與速效氮含量呈顯著負相關(guān)，與速效鉀、有效磷及 pH 呈極顯著負相關(guān)。有研究指出，速效氮含量增加會抑制真菌、細菌及放線菌的生長，高含量的有效磷可造成土壤養(yǎng)分比例失衡，細菌數(shù)目急劇下降，進而影響真菌群落組成[28]。由此可知，土壤中速效養(yǎng)分過高或養(yǎng)分比例不當均會對土壤微生物菌群組成存在不利影響。本研究中有效磷和子囊菌在速生期豐度均較高，可能是土壤中的子囊菌門中包含豐度較高的具有分解植物殘體和有機質(zhì)中的磷的作用的真菌，這些真菌通過分泌磷酸酶，將有機磷水解為磷酸根和其他無機磷轉(zhuǎn)化為有效磷，增加土壤磷的供應(yīng)，這一推論與本研究中有效磷和子囊菌顯著的正相關(guān)相呼應(yīng)。鉀是植物生長必需的營養(yǎng)元素，在土壤中可被植物直接吸收和利用，能夠影響植物根際群落結(jié)構(gòu)[29]。周玉杰等[29]認為土壤養(yǎng)分含量，尤其是速效鉀含量是橡膠林土壤真菌多樣性的重要影響因素，表明鉀元素與土壤微生物生態(tài)特征和土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切。綜上，通過對獼猴桃根際真菌群落與土壤理化因子的相關(guān)分析，結(jié)果表明，獼猴桃根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和組成(尤其是于囊菌門)變化，受土壤pH、有效磷、速效鉀的影響尤為顯著。

4 結(jié)論

獼猴桃苗不同生長期(生長前期、速生期、生長后期)土壤性質(zhì)存在顯著差異，各生長時期Shannon指數(shù)顯著差異。序列分析發(fā)現(xiàn)，子囊菌門(豐度72.69%)、被孢霉門(18.80%)、羅茲菌門(6.68%)、擔子菌門(4.28%)和球囊菌門(1.45%)是獼猴桃苗不同生長期的優(yōu)勢菌門。結(jié)合其他優(yōu)勢菌群在不同生長時期的明顯變化，可以看出，獼猴桃苗不同時期根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和組成以及所占的比例各不相同，與作物生長時期和植物類型有關(guān)。根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和組成(尤其是子囊菌門)變化受土壤pH、有效磷、速效鉀的影響尤為顯著，優(yōu)勢菌群和特有菌屬在獼猴桃生長期發(fā)揮特殊作用。該研究反映了獼猴桃苗生長過程中根際環(huán)境的變化，為在實踐中改良苗圃地微生物種群和土壤養(yǎng)分以及培育健壯苗木提供一定的指導(dǎo)。

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Fungal Community Structures and Diversities in Rhizosphere Soils in Different Growth Stages of Kiwifruit Seedlings Based on High-throughput Sequencing

REN Chunguang1, SU Wenwen1, PAN Lishan2, HAN Zhencheng1, WU Di1, LI Liangliang1, WANG Jiaguo1, LI Weijie1*

(1 Guizhou Institute of Mountain Resources, Guiyang 550001, China; 2 College of Forestry, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In this paper, Illumina MiSeq high-throughput sequencing was used to study the compositions and diversities of rhizosphere microbial community structures in three growth stages (pre-growth, fast-growing, and late-growth) of kiwifruit seedlings, and CANOCO and R language software were used for the analyses of RDA and correlation to disclose the relationship between soil fungal community and environmental factors. The results showed that significant differences existed in soil properties in different growth periods of kiwifruit seedlings. With continuous growth of roots, soil pH, available nitrogen and phosphorus increased first and then decreased, while available potassium gradually decreased. A total of 1 776 fungal OTUs were obtained by high- throughput sequencing, which belonged to 157 genera, 10 families, 22 classes and 151 families. Variation analysis showed that Shannon indexes were significantly different between different growth periods. Sequence analysis found that Ascomycota (72.69%), Mortierellomycota (18.80%), Rozellomycota (6.68%), Basidiomycota (4.28%) and Glomeromycota (1.45%) were the dominant phyla in different growth stages (the abundance greater than 1% is regarded as the dominant phylum), and Ascomycota increased first and then decreased while Mortierella, Rozelomycota and Basidiomycota decreased first and then increased. The relative abundance of Glomeromycota increased with the growth of roots. RDA analysis showed that soil available phosphorus and pH were significantly positively correlated with Ascomycota, available potassium negatively correlated with Ascomycota, and organic carbon significantly negatively correlated with Chytridiomycota. In conclusion, different rhizosphere soil fungal community structures were different in different growth periods of kiwifruit seedlings, the population of rhizosphere fungi was the most abundant in the fast-growing period and the least in the later growth period. Ascomycota, Mortierella, Rhodobacter and Basidiomycota were always the dominant rhizobacteria in the growth period of kiwifruit seedlings, rhizosphere fungi community composition and soil nutrients were different in different growth periods of kiwifruit seedlings, and soil available phosphorus and potassium were the important factors affecting the composition of ascomycetes community.

Kiwifruit; Rhizosphere community diversity; Soil environmental factors; Correlation analysis

S663.4

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.03.014

任春光, 蘇文文, 潘麗珊, 等. 基于高通量測序研究獼猴桃苗不同生育期根際真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性. 土壤, 2021, 53(3): 545–554.

貴州省科技廳青年基金項目(20171174)、貴州省科技支撐計劃項目(黔科合支撐[2018]2339)和貴州省科技廳科研服務(wù)企業(yè)項目(20194004)資助。

(104978155@qq.com)

任春光(1981—)，女，貴州印江人，博士，副研究員，主要研究方向為真菌資源及真菌病害。E-mail: 408558682@qq.com