張寶方，黃穗，李少英，夏勇，陳瑞瑞，林小影

深圳市寶安區(qū)婦幼保健院超聲醫(yī)學(xué)科1、病理科2、乳甲科3、中心實(shí)驗(yàn)室4、保健部5，廣東 深圳 518101

乳腺癌是一種對(duì)女性健康有嚴(yán)重影響的惡性腫瘤，從20世紀(jì)70年代末開始，全球乳腺癌的發(fā)病率呈逐年增長的趨勢，而我國一直是乳腺癌的高發(fā)國家，早發(fā)現(xiàn)、早治療患者在改善預(yù)后方面作用關(guān)鍵[1-2]。有效的影像學(xué)技術(shù)是診斷乳腺癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)展，高頻超聲(HFUS)在乳腺癌患者的診斷中也體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，其具有分辨率高、圖像清晰的特點(diǎn)，且可準(zhǔn)確檢測出微小乳腺癌腫塊等[3]。分子標(biāo)志物的檢測也是評(píng)估乳腺癌患者病情的重要方式，增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)、原癌基因(Her-2)、孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)是其中具有代表性的幾種標(biāo)志物，其在反映乳腺癌患者病情程度以及治療方面有重要意義[4-5]。本研究旨在探討乳腺癌患者HFUS 圖像與Ki-67、Her-2、PR、ER 表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析深圳市寶安區(qū)婦幼保健院2017年10月至2020年12月接診的110例乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)過影像學(xué)檢查、組織病理學(xué)檢查等確診為浸潤性導(dǎo)管癌；②納入研究前未接受過化療、放療等治療；③均為女性；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)合并其他良惡性腫瘤者；②合并重要器官功能異常者；③合并心腦血管疾病者；④合并全身重度感染、嚴(yán)重高血壓及糖尿病者；⑤合并血液系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)異常者；⑥妊娠期和哺乳期者。110 例乳腺癌患者年齡22～72 歲，平均(45.73±11.20)歲。本研究通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 HFUS 檢查 儀器選擇GE Voluson E8、GE LOGIQ E9和日立HI Vision Avius彩色多普勒超聲儀，探頭頻率設(shè)置為7～12 MHz。檢測方法：患者取平臥位，雙臂上舉，充分暴露乳腺和腋窩，超聲探頭對(duì)整個(gè)乳腺及腋窩進(jìn)行無遺漏掃查。主要觀察內(nèi)容包括腫塊大小、形態(tài)是否規(guī)則、有無微鈣化、是否有毛刺征、血流豐富程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、后方回聲有無衰減等情況。根據(jù)乳腺腫塊血流情況按照Alder分級(jí)進(jìn)行半定量評(píng)估，其中0級(jí)為無血流表現(xiàn)；Ⅰ級(jí)為存在少量血流表現(xiàn)，有1～2 個(gè)點(diǎn)狀或短棒狀血流，管經(jīng)＜1 mm；Ⅱ級(jí)為存在中量血流表現(xiàn)，有1 根主要血管或有3～4個(gè)點(diǎn)狀血流；Ⅲ級(jí)為存在大量血流表現(xiàn)，可見2根以上血管或4個(gè)以上點(diǎn)狀血流。以上超聲圖像分析結(jié)果均由兩名具有5 年以上工作經(jīng)驗(yàn)的超聲醫(yī)生分析得出，如存在爭議則請(qǐng)第3名具有相同或更高資歷的醫(yī)生進(jìn)行評(píng)判。

1.3 Ki-67、Her-2、PR、ER檢測及陽性率判斷方法

1.3.1 檢測方法 ER、PR、Her-2、Ki-67 的檢測均采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行，試劑盒購于深圳邁新公司。具體操作方法：①將病理組織切片常規(guī)石蠟包埋切片，使用二甲苯和梯度乙醇脫臘至水；②取適量已稀釋成工作液的檸檬酸組織抗原修復(fù)液于不銹鋼鍋中大功率加熱煮沸，將切片放入已沸騰的修復(fù)液中，最小功率繼續(xù)加熱20 min，冷卻至室溫后取出切片；③使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 次，每次沖洗時(shí)間5 min，加入3%過氧化氫室溫孵育15 min；④使用PBS沖洗3次，每次沖洗時(shí)間5 min，在離組織3 mm處用免疫組化油筆畫圈，并滴加ER、PR、Her-2、Ki-67 抗體，置于濕盒上37℃孵育1 h；⑤使用PBS 沖洗3 次，每次沖洗時(shí)間5 min，加入相應(yīng)酶標(biāo)二抗，置于濕盒上37℃孵育15min；⑥使用PBS 沖洗3 次，每次沖洗時(shí)間5 min，加入二氨基聯(lián)苯胺顯色液(DAB)顯色3 min 后水洗終止顯色，再經(jīng)過蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水以及二甲苯透明處理，使用中性樹脂膠進(jìn)行封片。

1.3.2 判讀方法 ER、PR、Ki-67 定位于細(xì)胞核，Her-2 定位于細(xì)胞膜，在高倍視野(×400)下觀察。(1)ER、PR：表達(dá)數(shù)量方面，觀察整張切片并分析陽性染色細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分比，陽性細(xì)胞數(shù)≥1%，則判定為ER、PR 表達(dá)陽性，并記錄陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)；表達(dá)強(qiáng)度方面，觀察整張切片，不著色為陰性(-)，淡黃色為弱陽性(+)，棕黃色為中等陽性(++)，棕褐色為強(qiáng)陽性(+++)，記錄表達(dá)強(qiáng)度。(2)Her-2：觀察陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及著色程度。①無染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整、微弱的細(xì)胞膜染色，計(jì)為0，Her-2 過表達(dá)情況評(píng)估為陰性；②＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整、微弱的細(xì)胞膜染色，計(jì)為+，Her-2過表達(dá)情況評(píng)估為陰性；③＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整和(或)弱至中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色，以及≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色，兩種情況均計(jì)為++，Her-2 過表達(dá)情況評(píng)估為不確定，需加做FISH 檢測；④＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色，計(jì)為+++，Her-2 過表達(dá)情況評(píng)估為陽性。(3)Ki-67：在低倍鏡下評(píng)估整張切片，觀察陽性細(xì)胞分布是否均勻。①若腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞分布較均勻，可隨機(jī)選取3 個(gè)或3 個(gè)以上浸潤性癌高倍視野計(jì)數(shù)，得出一個(gè)平均的Ki-67 增殖指數(shù)；②若腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞分布不均勻，出現(xiàn)明顯的Ki-67 增殖指數(shù)高表達(dá)區(qū)域。分兩種情況：(a)在腫瘤組織邊緣與正常組織交界處出現(xiàn)高表達(dá)區(qū)域，而腫瘤組織內(nèi)Ki-67增殖指數(shù)相對(duì)較低，選取腫瘤邊緣區(qū)域高表達(dá)區(qū)域≥3個(gè)浸潤性癌高倍視野進(jìn)行Ki-67 增殖指數(shù)評(píng)估；(b)在腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)高表達(dá)區(qū)域，對(duì)整張切片的Ki-67增殖指數(shù)進(jìn)行平均評(píng)估，選取視野時(shí)應(yīng)包括高表達(dá)區(qū)域在內(nèi)的≥3個(gè)浸潤性癌高倍視野。記錄陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，＜20%定義為Ki-67低表達(dá)，為統(tǒng)計(jì)方便，記為陰性，≥20%定義為Ki-67 高表達(dá)，記為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman 法分析HFUS 圖像和免疫組化指標(biāo)的相關(guān)性，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浸潤性乳腺癌患者的HFUS 圖像表現(xiàn) 110例浸潤性乳腺癌患者中，腫塊大小、腫塊形態(tài)、微鈣化、毛刺征、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血流、后方回聲分析的HFUS圖像表現(xiàn)見表1和圖1。

表1 乳腺癌患者的HFUS圖像表現(xiàn)(n=110)

圖1 乳腺癌患者的HFUS圖像

2.2 浸潤性乳腺癌患者HFUS 圖像與Ki-67、Her-2、PR、ER表達(dá)的關(guān)系 乳腺癌組織中Ki-67的陽性率為67.27% (74/110)，Her-2 的陽性率為28.18%(31/110)，PR 的陽性率為50.91% (56/110)，ER 的陽性率為67.27%(74/110)；Ki-67 在腫塊大小≥2 cm、無微鈣化及無毛刺征中的陽性率明顯更高，Her-2 在腫塊大小≥2 cm、血流分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性率明顯更高，PR在腫塊大?。? cm、后方回聲有衰減中的陽性率明顯更高，ER在腫塊大小＜2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性率明顯更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2和圖2。

圖2 免疫組化圖片(×400)

表2 乳腺癌患者HFUS圖像與Ki-67、Her-2、PR、ER表達(dá)的關(guān)系[例(%)]

2.3 浸潤性乳腺癌患者HFUS 圖像與Ki-67、Her-2、PR、ER 的相關(guān)性 經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析顯示，Ki-67 與腫塊鈣化、毛刺征呈負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)，Her-2 與腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P＜0.05)，PR與后方回聲呈正相關(guān)(P＜0.05)，ER 與腫塊大小呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，見表3。

表3 乳腺癌患者HFUS圖像與Ki-67、Her-2、PR、ER的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌患者近年來的發(fā)病率有趨于年輕化的表現(xiàn)，多數(shù)患者在就診時(shí)已處于疾病進(jìn)展期，導(dǎo)致治療效果差，遠(yuǎn)期生存率低，因此，盡早診斷、治療該病具有重要意義。鉬靶、CT、MRI 是該病中常見的檢查手段，但各自均具有一定局限性，主要作為輔助檢查手段[7]。HFUS是目前應(yīng)用最為普遍的一種檢查方式，也是乳腺疾病的首選檢查方式[8-9]。乳腺癌的超聲診斷由形態(tài)學(xué)逐漸向功能學(xué)發(fā)展，如今分子標(biāo)志物在乳腺癌的診療中占據(jù)重要地位，通過檢測乳腺癌患者的分子標(biāo)志物在評(píng)估病情方面也有重要價(jià)值。因此，本文通過分析乳腺癌超聲圖像與免疫組化各分子標(biāo)志物的相關(guān)性，旨在術(shù)前或治療前多方面了解腫瘤情況，為臨床制定治療方案及判斷預(yù)后提供更多依據(jù)。

Ki-67 屬于一種核增殖性腫瘤標(biāo)志物，在判斷腫瘤細(xì)胞活性中有重要指導(dǎo)價(jià)值，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移性相關(guān)，已有報(bào)道證實(shí)，其在乳腺癌組織中呈明顯升高趨勢[10-11]。本研究中發(fā)現(xiàn)，Ki-67 在腫塊≥2 cm、無腫塊鈣化、無毛刺征的患者中陽性率更高，在相關(guān)性分析中，Ki-67 和腫塊鈣化、毛刺征均呈負(fù)相關(guān)，與麥嘉雯等[12]研究結(jié)果一致。超聲檢查中容易對(duì)無微鈣化及無毛刺征的腫瘤漏誤診導(dǎo)致BI-RADS 分類低判而延誤病情，Ki-67作為乳腺癌化療的重要指征，在懷疑惡性的腫塊中未發(fā)現(xiàn)微鈣化及毛刺征時(shí)，應(yīng)考慮到Ki-67陽性可能性大。

Her-2 是一種原癌基因，屬于人體表皮生長因子成員，主要在細(xì)胞生長、增殖、分化等過程中發(fā)揮作用，當(dāng)其表達(dá)出現(xiàn)過多時(shí)可增加致癌作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞分化程度過低、侵襲性增強(qiáng)等，和乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移之間一定關(guān)聯(lián)[13]。本研究亦發(fā)現(xiàn)在腫塊大小≥2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血流分級(jí)Ⅱ～Ⅲ的乳腺癌組織中，Her-2的陽性表達(dá)率明顯升高，提示Her-2和腫瘤的惡變程度有密切關(guān)系，分析是由于在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，隨著新生毛細(xì)血管的形成，會(huì)增加腫瘤的惡性增殖速度，同時(shí)也更利于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

腫瘤的生長過程中容易受到組織內(nèi)激素的調(diào)控，其中PR、ER是其中具有代表性的因子，兩者均屬于核受體家族成員，在乳腺細(xì)胞的生長、發(fā)育等過程中扮演重要角色[14-15]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，PR、ER 均在腫塊大?。? cm的患者中的陽性率更高，PR在腫塊后方回聲衰減的陽性率更高，ER在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性率明顯升高，顯示出PR、ER在判斷乳腺癌患者病情方面的重要作用。ER、PR 陽性在一定程度上可反映其對(duì)內(nèi)分泌治療有效，且腫塊越小、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率越低，預(yù)后越好。PR陽性的腫塊中后方回聲衰減陽性率高，在某種程度上也可以間接預(yù)測乳腺癌的治療效果好。有研究顯示，通過藥物對(duì)靶性激素進(jìn)行抑制，令PR、ER 的活性喪失，會(huì)促使腫瘤細(xì)胞的內(nèi)生長環(huán)境失去平衡，有助于間接控制腫瘤生長[16]。

但本研究中也發(fā)現(xiàn)，Ki-67、Her-2、PR、ER和腫塊形態(tài)均無明顯關(guān)系，通過分析是由于腫瘤形態(tài)是向周圍組織浸潤生長的一種表現(xiàn)，當(dāng)腫瘤生長的速度、程度不一致的情況，則會(huì)導(dǎo)致腫瘤脫離正常組織平面進(jìn)行生長，但這種生長情況和腫瘤的惡性程度無明顯關(guān)聯(lián)，因此腫塊的形態(tài)和各分子標(biāo)志物之間無明顯關(guān)系。鈣化主要是由于腫瘤組織變性、壞死、鈣鹽沉積等因素所致，而在周成香等[17]研究中顯示，Her-2和乳腺癌組織微鈣化之間有相關(guān)，有助于提示腫瘤的侵襲性強(qiáng)，但本研究中未得出此結(jié)論，考慮是由于本研究屬于回顧性研究，樣本量不夠充足，在圖像分析中僅做了腫塊最佳或最大切面分析，可能忽略較大腫塊中的局部微鈣化，且醫(yī)師存在主觀性因素影響，待今后繼續(xù)分析研究。

綜上所述，乳腺癌患者HFUS 圖像與Ki-67、Her-2、PR、ER表達(dá)有一定相關(guān)性，通過檢測以上各項(xiàng)指標(biāo)，有助于綜合評(píng)估患者病情，臨床應(yīng)用價(jià)值高。