李百齊，許偉，李萍，高麗，宋琦，張庭婷

1.遵義醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，貴州 遵義 563099

在牙周病與心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)相關(guān)性研究中，關(guān)于牙周病原菌的研究較為常見，尤其是牙周病原菌與內(nèi)皮細(xì)胞之間的關(guān)系，一直是研究的重要內(nèi)容之一。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是一種重要的慢性牙周炎致病菌，內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)被認(rèn)為是其中最重要的一種毒力因素[1]，通?？梢蚤g接促進(jìn)CVD的發(fā)生和發(fā)展。

作為核轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)一般存在于細(xì)胞漿內(nèi)，其具有各類基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。這種因子通過某些信號通路參與人體內(nèi)細(xì)胞的感染、免疫、炎癥反應(yīng)等的發(fā)生[2]，當(dāng)它從胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核內(nèi)時，能夠通過合成炎癥反應(yīng)因子，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[3]。茶多酚(tea polyphenols，TP)是茶葉中多羥基酚類化合物的復(fù)合物，具有抗炎、抗氧化等生物活性，為茶葉保健功能的主要化學(xué)成分[4]。但TP抗炎作用機(jī)制是否與NF-κB有關(guān)目前鮮少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要觀測不同濃度TP 對Pg-LPS誘導(dǎo)的HUVECs中NF-κB p65表達(dá)影響，進(jìn)而探討TP對血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Pg-LPS(InvivoGen 公司)、TP(陸圣康源科技公司)、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)、細(xì)胞裂解液、核蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶公司)、NF-κB p65多克隆抗體(Abcam公司)等。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs 的培養(yǎng)及鑒定 獲得遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)同意后，筆者按照醫(yī)院倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成取材與細(xì)胞培養(yǎng)。選取足月妊娠的健康新生兒臍帶(由婦產(chǎn)科提供，告知患者及家屬具體實(shí)驗(yàn)途徑且得到準(zhǔn)許)，在4 h 內(nèi)開始細(xì)胞培養(yǎng)。常規(guī)換液，以1∶2 的比例做傳代培養(yǎng)，篩選3～4代對數(shù)生長期細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)樣本。實(shí)驗(yàn)前利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，選擇DAB免疫組織化學(xué)顯色法來作為細(xì)胞鑒定法完成細(xì)胞鑒定。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞活性檢測法 采用0.25%胰酶消化制備HUVECs細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×105個/孔，100 μL/孔接種到96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別設(shè)TP 組(5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L)和Pg-LPS組(0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)，于5%CO2、37℃、100%濕度培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)至規(guī)定時間：TP 組12 h、24 h、48 h，Pg-LPS 組4 h、8 h、24 h。結(jié)束后分別加入CCK-8 液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h 后取出，篩選出合適的藥物濃度及時間。實(shí)驗(yàn)分組為Control 組、Pg-LPS組、LPS+TP1組(5 mg/L)、LPS+TP2組(40 mg/L)。選取對數(shù)生長期HUVECs，通過0.25%胰蛋白酶完成細(xì)胞懸液的消化(細(xì)胞數(shù)為2×105/mL)，將其接種在6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，各孔加2 mL。保持原有環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞單層完全鋪滿6孔板底，在LPS+TP1組內(nèi)添加5 mg/L、LPS+TP2組添加40 mg/L TP培養(yǎng)液，其余各組進(jìn)行原培養(yǎng)液的更換。保持原環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進(jìn)行洗板后將Control組的原培養(yǎng)液加以更換，其余各組均添加10 μg/mL的Pg-LPS培養(yǎng)液并培育24 h，從而完成炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒐ぷ鳌?/p>

1.2.3 Western blot 法檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 蛋白含量 取HUVECs 離心后的上清液置于6 孔板內(nèi)，加入RIPA 裂解液提取出細(xì)胞總蛋白；同樣，加入漿蛋白抽提試劑提取出漿蛋白、加入核蛋白抽提試劑提取出核蛋白，定量采用BCA法。SDS-PAGE將各蛋白電泳分離，進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜。用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)在室溫封閉1 h，加入不同濃度稀釋濃度的一抗：NF-κB p65(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)和Histone H1(1∶1 000)，4℃輕搖過夜后先用TBST洗膜兩次，后滴加羊抗兔IgG二抗，比例為1∶20 000，室溫孵育1 h后漂洗3次，ECL顯影，蛋白相對表達(dá)量以β-actin和Histone H1為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA test)，組間多重比較采用最小顯著性差異法(LSD法)檢驗(yàn)；多重比較用Dunnett-T檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞來源鑒定 原代內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長，多呈梭形或多角形，胞核呈類圓形或圓形，可見1～2個核仁。細(xì)胞外觀呈現(xiàn)鋪路石狀排列(圖1)。經(jīng)第Ⅷ因子相關(guān)抗原熒光鑒定呈陽性，為內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)。

圖1 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞光鏡下形態(tài)(×200)

圖2 第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色(×200)

2.2 CCK-8 法對TP 和Pg-LPS 進(jìn)行藥物濃度的篩選

2.2.1 TP 對HUVECs 生長活力的影響 檢測后可發(fā)現(xiàn)HUVECs 的活性與TP 濃度、培養(yǎng)時間相關(guān)。同一濃度TP作用后，與24 h和48 h相比，作用12 h后的細(xì)胞增殖率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在濃度為5～40 mg/L 時，不同作用時間均促進(jìn)HUVECs 增殖，但達(dá)到80 mg/L 后便對細(xì)胞增殖率出現(xiàn)抑制作用。因此選取培養(yǎng)時間為12 h，濃度分別為5 mg/L、40 mg/L 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 不同濃度TP作用HUVECs的增殖率(n=6，，%)

表1 不同濃度TP作用HUVECs的增殖率(n=6，，%)

2.2.2 Pg-LPS 對HUVECs 生長活力的影響 與Control組相比，在不同時間和不同濃度條件下(4 h、8 h、24 h；0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)，Pg-LPS 均對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，其抑制率與作用時間和濃度相關(guān)(P＜0.05)，見表2。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將選取濃度為10 μg/mL Pg-LPS、作用時間為24 h 的條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：相同時間作用下，與Control組比較，aP＞0.05；bP＜0.05；相同濃度下，與4 h比較，cP＜0.05；與8 h比較，dP＜0.05。

2.3 Western blot 法檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 蛋白含量 NF-κB p65的蛋白含量及蛋白相對表達(dá)見圖3和表3。與Control組比較，經(jīng)Pg-LPS處理后的細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)增加，胞漿內(nèi)p65表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與Pg-LPS 組相比較，經(jīng)TP 處理后的細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)降低，胞漿內(nèi)p65表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

注：與Control 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與LPS+TP1組比較，cP＜0.05。

圖3 Western Blot法測定細(xì)胞NF-κB p65蛋白相對表達(dá)

3 討論

相關(guān)研究認(rèn)為牙周疾病與全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病、CVD 等均有著密切的關(guān)系[5]。牙周感染與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的相關(guān)性已有許多學(xué)者研究以及輔以流行病學(xué)進(jìn)行佐證，而細(xì)胞因子之間的相互作用正是牙周病與AS之間產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的生物學(xué)基礎(chǔ)[6-7]，特別是牙周致病菌感染如牙齦卟啉單胞菌、放線桿菌集合菌、中間小球藻、連翹坦索菌和核梭菌等均對AS的形成與進(jìn)展有一定的貢獻(xiàn)[8-9]。

內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是AS 產(chǎn)生的最早、最主要的血管表現(xiàn)之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放的活性因子是調(diào)控血管舒張功能的重要因素。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞微循環(huán)發(fā)生障礙時，炎性因子產(chǎn)物增多，進(jìn)而發(fā)生炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)能力會受損。吳贇等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pg-LPS 終濃度分別為0.1 mg/L 和1.0 mg/L時，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均會產(chǎn)生早期焦亡表現(xiàn)，當(dāng)濃度升至10 mg/L、培養(yǎng)時間為72 h 時會出現(xiàn)細(xì)胞死亡等現(xiàn)象，這反映Pg-LPS通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能來產(chǎn)生作用，對AS的發(fā)生機(jī)制有一定的意義，進(jìn)而在牙周病與AS的相互關(guān)聯(lián)中發(fā)揮了作用。研究表明，茶葉中的提取物TP對抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞障礙等方面有重大作用[11-14]。王忠麗[15]在其研究中提到，為了檢測高糖環(huán)境下TP對內(nèi)皮細(xì)胞的作用，應(yīng)用TP(濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L)對內(nèi)皮細(xì)胞分別進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞內(nèi)內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metallop roteinase inducer，EMMPRIN)的表達(dá)變化，最終得出結(jié)論，高糖環(huán)境下可通過p38MAPK 信號通路抑制HUVECs 的活性，而20 mg/L TP 可以抑制此作用以促進(jìn)EMMPRIN 的表達(dá)，抑制HUVECs 表達(dá)ET-1，進(jìn)一步保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞；但在30 mg/L 濃度下，TP 雖然可以降低高糖環(huán)境對細(xì)胞的影響，但對正常細(xì)胞活性有所影響。在本實(shí)驗(yàn)中CCK-8 檢測結(jié)果顯示：①與Control 組相比較，不同濃度的TP 與HUVECs 一起培養(yǎng)12 h，當(dāng)TP 濃度為80 mg/L 時促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用減弱，達(dá)到160 mg/L時可呈負(fù)值，表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖的抑制作用；在同一濃度條件下，將TP 作用時間延長至24 h 和48 h，其產(chǎn)生抑制作用需要達(dá)到的濃度與時間呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TP既能夠促進(jìn)HUVECs增殖，也能抑制細(xì)胞增殖，其促進(jìn)或抑制作用取決于TP作用的時間長短或濃度高低：若TP濃度低于80 mg/L，則會對HUVECs增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用，若TP 濃度高于80 mg/L 則對HUVECs的增殖產(chǎn)生抑制作用(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？偟膩碚f，隨著TP作用時間增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用減弱，抑制細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)。②與Control組相比較，不同濃度的Pg-LPS 對于HUVECs 的抑制作用不同。在不同時間、不同濃度條件下(4 h、8 h、24 h；0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)，Pg-LPS均可抑制HUVECs的增殖作用，且其抑制率隨時間和濃度的增加而提高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)推測TP對HUVECs的增殖與抑制作用可能與濃度及時間有密切的關(guān)系，研究結(jié)果也與相關(guān)研究結(jié)果基本一致。但對于TP出現(xiàn)的低濃度促進(jìn)、高濃度抑制與短時促進(jìn)、長時抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象，還需更深入地研究其作用機(jī)制。

NF-κB是人體內(nèi)炎癥因子被激活、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)重要的一環(huán)。WANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TP中的主要兒茶素(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)通過抑制NF-κB活化來抑制HUVECs 中TNF-α誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)。李昆蔓等[17]認(rèn)為，NF-κB/iNOS/NO是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖凋亡失衡時發(fā)揮重要作用的信號通路，處于非生理狀態(tài)時，NF-κB被激活會導(dǎo)致其表達(dá)增強(qiáng)，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與炎癥反應(yīng)。此實(shí)驗(yàn)也通過Pg-LPS來完成對內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)，他們認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞可能是受到該激活后的信號通路的影響，并導(dǎo)致AS癥狀的發(fā)生和發(fā)展。ZHANG等[18]發(fā)現(xiàn)，LPS通過誘導(dǎo)NF-κB信號通路的激活，使得磷酸化p65蛋白表達(dá)增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示：①與Control 組相比，經(jīng)Pg-LPS 誘導(dǎo)后的HUVECs 細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)升高，而胞漿內(nèi)NF-κB p65 表達(dá)下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②與Pg-LPS 組相比，用一定濃度TP預(yù)處理HUVECs后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低，且胞漿內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測TP 可以抑制Pg-LPS 的誘導(dǎo)作用?？偨Y(jié)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為TP 可以抑制NF-κB p65由胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，即可能抑制NF-κB的活化。結(jié)果與以往研究基本一致，推測TP抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)炎癥反應(yīng)可能與抑制NF-κB的活化有關(guān)。

綜上所述，TP對內(nèi)皮細(xì)胞的作用與濃度及時間密切相關(guān)，其作用在有效范圍內(nèi)具有濃度依賴性：具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制與短時促進(jìn)、長時抑制細(xì)胞增殖的特點(diǎn)。其次，TP 通過抑制NF-κB 的活化來抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可以對內(nèi)皮細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。雖然有部分研究證明TP在糖尿病、AS等疾病中有潛在功能進(jìn)行預(yù)防和治療，但尚未有實(shí)驗(yàn)證明其對人類健康的影響[19-21]，本實(shí)驗(yàn)雖然并未在體內(nèi)模擬條件下對TP進(jìn)行分析，對于TP能否產(chǎn)生相同作用也需進(jìn)一步研究，但本實(shí)驗(yàn)可以得出：TP在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可以通過抑制NF-κB的活化來抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。