孔佑虔 宋愛英 王小玉 唐寅★

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）為我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，盡管近年來(lái)影像技術(shù)、外科手術(shù)、放療、化療等醫(yī)學(xué)手段快速發(fā)展，但大部分患者就診時(shí)仍處于肺癌晚期，故早期診斷NSCLC 病情進(jìn)展、及時(shí)采取治療措施是提高該病診療率的關(guān)鍵［1］。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1（excision repair cross -complementation group l，ERCC I）基因在多種腫瘤細(xì)胞均呈高表達(dá)狀態(tài)，對(duì)腫瘤DNA 的合成、再生起到重要作用［2］。報(bào)道發(fā)現(xiàn)P21 活化激酶（p21-activated kinase，PAK）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有關(guān)［3］。組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1，HDAC1）可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生細(xì)胞毒性［4］。本研究將分析免疫組化檢測(cè)ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白的表達(dá)及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2015年1月至2017年6月收治的62例NSCLC 患者。分型：鱗癌27 例，腺癌21 例，腺鱗癌14 例。男36 例，女26 例，平均年齡（51.31±6.65）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者符合NSCLC 規(guī)范化的診斷［5］；②術(shù)前未接受輔助治療；③無(wú)其它惡性疾??；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎、心臟臟器嚴(yán)重疾病者；②合并嚴(yán)重神經(jīng)功能、認(rèn)知功能障礙者；③依從性差者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集及ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

將術(shù)中切取的癌組織作為癌組織組，將癌旁正常組織（距離腫瘤5 cm）作為癌旁正常組織組。檢測(cè)ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白［6］：SP 法，石蠟切片標(biāo)本厚2 μm，烘烤60℃，二甲苯脫蠟，浸泡3次。3 次離子水中浸泡抗原修復(fù)切片，磷酸鹽緩沖液（PBST）洗3 次。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑滴加，室溫孵育15 min，沖洗。一抗（GPCR124 多克隆抗體濃度1∶100）滴加，室溫孵育1 h，沖洗。辣根酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG 聚合物滴加，室溫孵育30 min。 對(duì)照組采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

1.3 臨床病理特征及隨訪

對(duì)所有患者性別、年齡、臨床分期、組織分化程度、ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)情況及其預(yù)后情況進(jìn)行記錄。采用雙盲法［7］評(píng)定ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白：隨機(jī)選擇每張切片5 個(gè)視野，根據(jù)染色深淺和視野中陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：0分為無(wú)著色；1 分為淺黃色，＜25%；2 分為棕黃色，25%～50%；3 分為棕褐色，＞50%。免疫反應(yīng)評(píng)分：陰性（-），弱陽(yáng)性（+），中等陽(yáng)性（++），強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。低表達(dá)狀態(tài)為陰性和弱陽(yáng)性（-，+），高表達(dá)狀態(tài)為中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性（++，+++）。所有患者均隨訪3年，隨訪截止日期為2020年6月30日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用ROC 曲線研究ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白對(duì)患者預(yù)后生存的影響，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ERCC1、PAK及HDAC1蛋白表達(dá)情況比較

癌組織組ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白陽(yáng)性率表達(dá)顯著高于癌旁正常組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of ERCC1，Pak and HDAC1 protein expression between 2 groups［n（%）］

圖1 NSCLC 癌組織免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 immunohistochemical staining of cancer tissue of NSCLC（SP，×500）

2.2 不同臨床病理特征NSCLC 患者其ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)情況比較

ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白高表達(dá)者臨床分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯高于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征NSCLC 患者其ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)情況比較［n（%）Table 2 Comparison of ERCC1，Pak and HDAC1 protein expression in NSCLC patients with different clinicopathological characteristics［n（%）］

2.3 NSCLC 患者ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)的預(yù)后情況

62 例NSCLC 患者3年生存率為19.35%（12/62），ERCC1、PAK 及HDAC1 高表達(dá)者死亡率高于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 NSCLC 患者ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白表達(dá)的預(yù)后情況［n（%）］Table 3 prognosis of ERCC1，Pak and HDAC1 protein expression in NSCLC patients［n（%）］

2.4 ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白對(duì)NSCLC 患者預(yù)后死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白及三者聯(lián)合曲線下面積分別為0.786、0.770、0.748、0.973，各指標(biāo)曲線下面積以聯(lián)合檢測(cè)最大（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白對(duì)NSCLC 患者預(yù)后死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 4 the predictive value of ERCC1，Pak and HDAC1 protein in the prognosis of NSCLC patients

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

3 討論

NSCLC 具有極高的惡性程度，早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，雖手術(shù)治療療效顯著，但預(yù)后較差，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使患者的5年生存率僅為30%左右［8］。

ERCC1 是核苷酸切除修復(fù)中最為關(guān)鍵的酶，通過(guò)對(duì)染色體19q13.2 - 13.3 定位，使基因突變引起單核苷酸多態(tài)性遺傳物質(zhì)DNA 突變，而單核苷酸多態(tài)性通過(guò)轉(zhuǎn)錄mRNA 及由其翻譯成的蛋白或酶發(fā)揮功能作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1 參與多種腫瘤的進(jìn)展［9］。Lu 等［10］研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 蛋白陽(yáng)性對(duì)肺癌患者的用藥選擇具有指導(dǎo)意義。HDAC1蛋白是臨床新發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)蛋白，相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1 蛋白在惡性腫瘤中呈過(guò)度表達(dá)狀態(tài)［11］。相關(guān)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1 抑制劑可抑制肺腺癌細(xì)胞株A549 的增殖并促進(jìn)其凋亡，預(yù)示HDAC1 抑制劑在肺癌治療中具有重要作用［12］。PAK 作為小G 蛋白R(shí)ho 家族的下游靶蛋白，被生長(zhǎng)因子及其他胞外信號(hào)活化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞生存、有絲分裂和血管生成等生物學(xué)功能，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用［13］。既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)PAK 在不同腫瘤中可通過(guò)不同的信號(hào)通路影響腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌癥進(jìn)展［14］。目前，有關(guān)PAK 在腫瘤方面的報(bào)道主要集中在乳腺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤疾病中，而在NSCLC 方面的研究報(bào)道甚少［15］。由此可知NSCLC 患者疾病的發(fā)生和進(jìn)展與ERCC1、PAK、HDAC1 蛋白有著密切聯(lián)系，三者可作為評(píng)估其預(yù)后的有效指標(biāo)。

此外，為深入了解ERCC1、PAK、HDAC1 蛋白對(duì)NSCLC 患者預(yù)后死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值，本研究采用ROC 曲線分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)三指標(biāo)可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后死亡的有效手段。

綜上所述，ERCC1、PAK 及HDAC1 蛋白在NSCLC 癌組織中呈異常表達(dá)狀態(tài)，臨床工作者可通過(guò)監(jiān)測(cè)上述指標(biāo)判斷NSCLC 患者疾病進(jìn)展情況，為評(píng)估患者預(yù)后發(fā)展提供參考。