何姍姍 駱建美 劉賢 宋旭彤

乳腺癌為女性惡性腫瘤的發(fā)病之首，死亡率極高［1］。據(jù)相關(guān)資料顯示，我國乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，且以每年3%～4%的增長速度不斷增加，因乳腺癌早期診斷率較低，大多數(shù)患者預(yù)后不理想［2］。既往文獻報道，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中由多種蛋白共同參與，對乳腺癌發(fā)生的機制、診斷及治療進行深入研究，對改善患者預(yù)后，延長生存期有重要意義［3］。miRNA 可阻遏靶基因的翻譯，血清微小RNA34（microRNA34，miR34）是miRNA 中一類高度保守的抑癌基因，能抑制靶基因表達［4］。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是腫瘤生成過程中特異性最高的促血管生長因子，可促進腫瘤細(xì)胞生長、增殖［5］?？扇苄园准?xì)胞介素-2 受體（Solubleinterleukin-2receptor，sIL-2R）是腫瘤壞死因子細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，在抗病毒和抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著重要的作用［6］。國內(nèi)外文獻關(guān)于miRNA、VEGF-C 及sIL-2R與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究較少。本研究通過檢測乳腺癌患者血清miRNA、VEGF-C 及sIL-2R水平，分析聯(lián)合三者檢測對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2019年3月在本院就診的97 例乳腺癌患者，根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組40 例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組57 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理組織活檢并確診為乳腺癌［7］；②納入研究前未服用過影響激素水平的藥物；③無其他惡性腫瘤病史；④均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重免疫力缺陷者；②合并嚴(yán)重精神類疾病，無法正常溝通者；③子宮內(nèi)膜炎、盆腔子宮內(nèi)膜異位癥及其他生殖系統(tǒng)疾病者；④一般資料不齊全者。選取同期在本院進體檢的97 例健康者作為對照組。3 組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

表1 3 組患者一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of 2 groups（±s）

表1 3 組患者一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of 2 groups（±s）

組別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組對照組F/χ2值P 值n 40 57 97年齡（歲）53.37±4.35 53.45±4.39 53.22±4.11 0.060 0.946平均體重（kg）54.30±3.89 54.39±3.92 53.12±3.75 1.440 0.240病程（年）4.43±0.55 4.32±0.50 1.810 0.168乳腺癌家族史（有/無）5/35 7/50 8/89 0.893 0.640

1.2 方法

1.2.1 miR-34 檢測方法

采用實時熒光定量PCR 檢測各組中miR-34相對表達量。RNA 提取試劑Trizol 購自寶生物工程（大連）有限公司。RT-PCR 引物序列如下：miR-34 正 向 引 物 為5′-CAA TCG GGT ACT TGC TGG GCT TTC3′，反向引物為5′-GAG GGC CAT ACC TTA ACG CGT TAA TG3′。PCR 反 應(yīng) 體 系共20 μL。其中，熒光混合物10 μL，10 μmol/L。正向引物和反向引物各1 μL，50×ROX 染料II 0.5 μL、cDNA 模板1 μL，雙蒸水6.5 μL。反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，共40 個循環(huán)。miR-34 以U6 為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.2 VEGF-C、sIL-2R 檢測方法

對照組于體檢當(dāng)日，乳腺癌患者于入院后次日清晨8：00 空腹抽取肘靜脈血4 mL，其中2 mL 用含0.109 mol/L 枸櫞酸1∶9 抗凝，3 500 r/min 離心10 min 分離血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測VEGF-C、sIL-2R，試劑盒由美國貝克曼庫爾特提供，檢測儀器為DXI800 美國貝克曼庫爾特全自動免疫分析儀。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗、多組間比較采用F檢驗；計數(shù)資料通過n（%）表示，采用χ2檢 驗；繪制ROC 曲 線，并 計 算ROC 曲線下面積（AUC），以分析miR-34、VEGF-C 及sIL-2R 檢測及三者聯(lián)合檢測對對乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組之間miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較

3 組之間miR-34 水平比較：對照組＞無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組＞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3 組之間VEGF-C、sIL-2R 水平比較：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組＞無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組＞對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組之間miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 2 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels among groups（±s）

表2 各組之間miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 2 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels among groups（±s）

組別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組對照組F 值P 值n 40 57 97 miR-34 1.92±0.17 2.64±0.29 3.59±0.35 475.370＜0.001 VEGF-C（ng/L）534.45±49 .87 421.12±45.47 226.65±37.52 857.390＜0.001 sIL-2R（U/mL）765.32±59.65 512.14±47.14 325.48±40.69 1270.350＜0.001

2.2 不同病理特征組中miR-34、VEGF-C、sIL-2R水平比較

病理學(xué)分級為低、中分化的患者miR-34 低于高分化者，VEGF-C、sIL-2R 高于高分化者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者miR-34 高于Ⅲ～Ⅵ期者，VEGF-C、sIL-2R 低于Ⅲ～Ⅵ患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有淋巴血管間隙浸潤的患者miR-34 低于無淋巴血管間隙浸潤者，VEGF-C、sIL-2R 高于無淋巴血管間隙浸潤者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同病理特征組中miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 3 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels in different pathological characteristics groups（±s）

表3 不同病理特征組中miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 3 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels in different pathological characteristics groups（±s）

臨床特征年齡腫瘤最大直徑（cm）腫瘤數(shù)目病理學(xué)分級TNM 分期淋巴血管間隙浸潤＜50≧50＜5≧5單發(fā)多發(fā)低、中分化高分化Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅵ期有無n 51 46 42 55 39 58 47 50 58 39 43 54 miR-34 3.10±0.35 2.99±0.33 3.11±0.31 3.05±0.27 3.12±0.37 2.98±0.34 2.89±0.31 3.55±0.38 3.48±0.37 2.94±0.33 2.68±0.35 3.39±0.41 t 值1.588 1.017 1.919 9.381 7.587 9.032 P 值0.116 0.312 0.058＜0.001＜0.001＜0.001 VEGF-C 407.25±30.14 410.12±30.25 388.35±39.65 395.32±40.12 396.32±41.13 401.21±41.33 551.32±50.36 412.12±41.55 421.36±40.46 537.65±48.63 539.27±42.15 433.12±35.65 t 值0.467 0.852 0.572 14.845 12.357 13.434 P 值0.641 0.396 0.568＜0.001＜0.001＜0.001 sIL-2R 554.65±69.46 551.32±69.10 534.69±70.33 530.14±51.36 514.65±53.45 517.37±63.89 752.12±71.23 503.36±59.12 516.78±62.35 733.64±68.98 741.23±71.14 523.45±61.25 t 值0.236 0.368 0.219 18.700 15.770 16.192 P 值0.814 0.714 0.827＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 聯(lián)合miR-34、VEGF-C、sIL-2R 檢測對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

miR-34、VEGF-C、sIL-2R 三者聯(lián)合檢測靈敏度、特異度分別為93.65%、94.23%，顯著高于單一檢測（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 聯(lián)合miR-34、VEGF-C、sIL-2R 檢測對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值Table 4 predictive value of combined detection of miR-34，VEGF-C and sIL-2R in lymph node metastasis of breast cancer

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC Curve

3 討論

乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一過程是由多基因及多種生化標(biāo)志物共同參與的，由于腫瘤抑制基因、生化指標(biāo)功能喪失，進而表現(xiàn)出細(xì)胞不受調(diào)控的增殖、分化和凋亡抑制等［8］。因此，臨床上致力于尋找更多高特異度的乳腺癌相關(guān)基因，以期通過多個指標(biāo)聯(lián)合檢測為乳腺癌的診斷、病情評估、靶向治療及預(yù)后風(fēng)險評估提供依據(jù)。

本研究中，三組之間miR-34 水平比較：對照組＞無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組＞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；三組之間VEGFC、sIL-2R 水平比較：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組＞無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組＞對照組，與國外研究報道結(jié)果一致［9］。因此可以推測miR-34、VEGF-C 及sIL-2R 表達對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有顯著的影響作用。miRNA 是一類高度保守的非編碼內(nèi)源性RNA 分子，可通過結(jié)合于其下游靶基因3′端非編碼區(qū)，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為［10］。VEGF-C 是腫瘤細(xì)胞生長過程中重要的血管內(nèi)皮因子，特異性高，而乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移依賴于血管生成［11］。sIL-2R 是機體重要的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，對于巨噬細(xì)胞的吞噬作用有明顯的刺激作用，一定程度上促進患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［12］。低表達的miR-34 會影響腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進細(xì)胞凋亡，而高水平的VEGF-C 及sIL-2R 對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定促進作用，對促進乳腺癌病情進展有顯著影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)，病理學(xué)分級（低、中分化）、TNM（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴血管間隙浸潤的患者miR-34 表達量較低，VEGF-C、sIL-2R 水平較高，認(rèn)為低表達量的miR-34、高水平的VEGF-C、sIL-2R 會推動病情進展，促進癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與Shah 等學(xué)者［13］研究結(jié)論一致。miR-34 是miRNA家族中有抑癌作用的一類基因，在結(jié)直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤中均呈異常低表達狀態(tài)，研究認(rèn)為miR-34 異常低表達可作為惡性腫瘤診斷、病情評估、預(yù)后的標(biāo)志［14］。VEGF-C 是一種由多種細(xì)胞分泌的糖蛋白，有較高的血管滲透性，為腫瘤細(xì)胞生長、增殖提供了有利條件［15］。sIL-2R 由多淋巴細(xì)胞合成，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與機體炎癥因關(guān)系密切。既往研究發(fā)現(xiàn)，sIL-2R 可作為免疫抑制劑，改善機體內(nèi)分泌，通過抑制已活化的T 細(xì)胞克隆抑制機體免疫力，促進惡性腫瘤分化、增殖［16］。相關(guān)研究指出，結(jié)直腸癌患者中sIL-2R 表達水平較高，認(rèn)為sIL-2R 對癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移均有一定預(yù)測作用［17］。

繪制ROC 曲線結(jié)果表明聯(lián)合miR-34、VEGFC、sIL-2R 檢測可用于預(yù)測乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

綜上所述，miR-34、VEGF-C、sIL-2R 與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，聯(lián)合三者檢測對評估乳腺癌病情、預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作用重大。