于婷 孫楠 孫晶 黃杰 曲守方

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由肌營養(yǎng)不良蛋白（dystrophin）基因突變所致的X-連鎖隱性遺傳病，是一種嚴(yán)重的、致死性神經(jīng)肌肉疾?。?-3］。DMD患者多在20 多歲死于呼吸衰竭或心力衰竭［4］，迄今為止尚無治愈的方法。因此，對DMD患者及攜帶者行基因診斷，以及高風(fēng)險(xiǎn)胎兒行產(chǎn)前診斷［5］，顯得格外重要。目前DMD基因突變檢測試劑盒均未取得醫(yī)療器械注冊證，多在第三方檢測機(jī)構(gòu)使用或者僅用于科研。多家公司正在開展DMD檢測試劑盒醫(yī)療器械注冊證的申報(bào)，以便合法合規(guī)進(jìn)入醫(yī)院。建立DMD基因突變檢測國家參考品可為這類試劑盒性能評價提供客觀有效的評價手段。2019 起中國食品藥品檢定研究院（下稱本院）開展了DMD基因突變檢測國家參考品的研制工作。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

外周血樣來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所、廣州市婦女兒童醫(yī)療中心。本研究的臨床基本信息收集和臨床血樣的采集均獲得了醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，以及患兒或家屬的知情同意，簽署了知情同意書。

1.2 試劑

多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）檢測試劑盒（蘇州貝康），SALSA MLPA 檢測試劑（MRCHolland）；二代測序法（next generation sequencing，NGS）檢測試劑盒：①半導(dǎo)體測序法：蘇州貝康、東莞博奧木華；②可逆末端終止測序法：北京貝瑞和康、邁基諾、亞能（深圳）、歐蒙未一；③靶向測序法：成都納海；④聯(lián)合探針錨定聚合測序法：天津華大。

1.3 檢測儀器

ABI 3730XL、ABI SeqStudio 及ABI 3730X 基因分析儀（賽默飛）；DA8600 Ion Proton 高通量測序儀（達(dá)安基因），NovaSeq 6000 基因測序儀及Miseq 基因測序儀（美國，Illumina 公司），BioelectronSeq 4000 基因測序儀（博奧生物），MGISEQ-2000 PE100 基因測序儀（華大智造）。

1.4 方法

1.4.1 樣本篩選及采集

根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的常見DMD突變，作為參考品備選范圍，采集DMD患兒及其家系外周血（不少于10 mL），-70℃以下保存。

1.4.2 國家參考品制備

采用外周血建立DMD基因突變的永生化細(xì)胞系后，進(jìn)行擴(kuò)增及DNA 提取，最終每份樣本每管稀釋至25 ng/μL 左右。

1.4.3 國家參考品驗(yàn)證及均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)

8 個廠家采用了10 種檢測試劑對參考品進(jìn)行DMD基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證。本次驗(yàn)證僅給出家系信息，不給出DMD基因突變的具體信息。各參加單位根據(jù)試劑說明書或者實(shí)驗(yàn)室SOP 進(jìn)行檢測。要求：①NGS 試劑按照各自聲稱的檢測限對樣本測定1 次即可；MLPA 試劑按照原濃度和檢測限濃度各測定1 次；②均勻性：NGS 試劑和MLPA 試劑各測定3 次；③穩(wěn)定性：MLPA 試劑測定反復(fù)凍融3 次后的樣本。

2 結(jié)果

2.1 參考品組成

共建系成功46 份樣本，包含16 個家系及3 份獨(dú)立的患兒樣本。樣本DMD基因突變信息包括：外顯子缺失及重復(fù)，以及點(diǎn)突變或微小缺失，具體見2.2 驗(yàn)證結(jié)果。

2.2 驗(yàn)證結(jié)果

驗(yàn)證結(jié)果見表1，MLPA 法試劑檢測結(jié)果一致，NGS 法試劑檢測的結(jié)果，大部分一致，部分結(jié)果存在差異。

表1 DMD 基因突變檢測候選參考品驗(yàn)證結(jié)果匯總表Table 1 The summary of validation results for the candidate reference of detection of DMD

2.3 參考品均勻性及穩(wěn)定性結(jié)果

均勻性實(shí)驗(yàn)中，NGS 試劑和MLPA 試劑各自測定結(jié)果一致；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，MLPA 試劑測定反復(fù)凍融3 次后的樣本，結(jié)果與正常保存樣本的結(jié)果一致。

3 討論

目前對DMD的分子診斷方法，主要可分為兩種類型，即對外顯子缺失和重復(fù)突變的檢測，以及微小突變的檢測。對于缺失和重復(fù)突變的檢測主 要 有多 重PCR［6］、比 較基因 組雜交 芯片［7］及MLPA［8-9］等。多重PCR 法多用于明確先證者的突變類型后，對家系其他成員進(jìn)行已知突變位點(diǎn)的檢測；MLPA 作為一種高通量、針對待測核酸中靶序列進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)，可檢測出DMD基因全部外顯子的缺失和重復(fù)突變，并能檢出攜帶者，應(yīng)用最為廣泛，商品化的MLPA 正逐步取代多重定量PCR 等方法；NGS 技術(shù)除可檢測到缺失和重復(fù)外，可快速有效檢測點(diǎn)突變和微小突變［10-11］。當(dāng)前對DMD的基因檢測策略普遍是先對患者進(jìn)行MLPA 檢測，然后對未發(fā)現(xiàn)突變的患者進(jìn)行基因組DNA 分析［12-15］。本次驗(yàn)證過程中，即采用了上述的MLPA 法和NGS 法。

為評估DMD基因突變檢測試劑盒的分析性能，DMD國家參考品的原料選用臨床外周血，以保持與臨床樣本的一致性，并盡可能涵蓋多種突變類型。MLPA 試劑檢測結(jié)果一致，表明該方法成熟可靠。而NGS 結(jié)果不一致，主要原因如下：①選擇了不同的轉(zhuǎn)錄本：NM_000109 和NM_004006，所以突變位點(diǎn)信息表述不同，但結(jié)果一致；②某實(shí)驗(yàn)室只檢SNV/Indel 變異，所以未報(bào)DMD 外顯子缺失或突變。在此基礎(chǔ)上，再對有爭議樣本的突變信息分析：①3 號樣本，僅2 家檢出NM_004006.2：c.412_413delAA。對該位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行Sanger 測序驗(yàn)證，確認(rèn)該致病突變存在；②4、13、14、32、42、43 號樣本，多家亦有檢出其他突變位點(diǎn)，根據(jù)ACMG2015 指南判為VUS，無明確臨床意義，不報(bào)告該突變；③37 號樣本同時存在XO 情況，XX 部分為外顯子5-7 雜合重復(fù)，XO 部分為外顯子5-7 半合重復(fù)，并且XO 體細(xì)胞占比偏高導(dǎo)致了檢測信號為純合。因本參考品主要考察DMD基因突變情況，此處嵌合，不做評價，檢出外顯子5-7 重復(fù)即可；④當(dāng)僅1 家與其他家結(jié)果不一致時，不采信該實(shí)驗(yàn)室結(jié)果（如10、22、38 號樣本）。以上結(jié)果表明，檢測結(jié)果出現(xiàn)差異時，應(yīng)重點(diǎn)考慮兩方面，一是當(dāng)樣本存在嵌合時，由于測序深度及嵌合程度的影響，可能出現(xiàn)DMD基因突變無法檢出的情況；第二，對于突變是否具有致病意義的認(rèn)識程度不同，未按照ACMG2015 指南進(jìn)行突變的判斷，以致給出過多無臨床意義的突變信息。廠家對于檢測到的突變信息應(yīng)進(jìn)行預(yù)先識別確認(rèn)，不應(yīng)測到即報(bào)，否則不僅給臨床造成不便，而且對于患者及其家庭會造成一定的心里壓力。通過協(xié)作驗(yàn)證，最終給出采用該參考品進(jìn)行試劑盒質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)為：檢測范圍內(nèi)的缺失、重復(fù)及突變位點(diǎn)均應(yīng)檢出；試劑盒檢測范圍外的突變應(yīng)為野生型或未檢出。因樣本為臨床樣本，給出的突變信息僅限于根據(jù)當(dāng)前指南判為致病的突變信息。如在應(yīng)用過程中有檢出的突變上升到致病等級，將在驗(yàn)證之后，及時更新相關(guān)信息。通過均勻性和穩(wěn)定性研究，該參考品均滿足要求，且應(yīng)用性良好，可以作為國家參考品應(yīng)用。今后還將對該候選參考品進(jìn)行期間核查及長期穩(wěn)定性研究。

目前已發(fā)現(xiàn)DMD致病突變位點(diǎn)類型達(dá)上百種，然而多數(shù)突變所致的發(fā)病率并不高，因此要想制備包括DMD全部突變的大panel 并不現(xiàn)實(shí)。這套國家參考品突變位點(diǎn)包含了主要的缺失突變、重復(fù)突變和微缺失突變?nèi)N類型，基本可以滿足評價DMD檢測試劑盒性能的要求，并且將在今后根據(jù)需要逐步擴(kuò)充新的DMD突變基因突變位點(diǎn)。