薛瑩瑩 張 濤 楊婷婷 陳遠(yuǎn)濤 張鈞煜 萬(wàn) 浩 葉 瑋* 王 平#*

1(浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院, 生物傳感器國(guó)家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310027)2(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

引言

口腔疾病是全球最流行的疾病之一，影響超過(guò)35億人口，接近全球人口的一半。口腔疾病包括一系列影響牙齒和口腔的慢性臨床疾病，如齲齒、牙周病和口腔癌[1-2]?？谇患膊≡趽p害患者健康的同時(shí)，還會(huì)帶來(lái)口腔異味，即口臭?？诔粲绊懥巳澜缂s50%～65%的人口，給患者日常生活造成極大的困擾[3]。此外，口腔疾病往往容易受到忽視，而治療口腔疾病的費(fèi)用昂貴，可能給患者帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。因此，口腔疾病(尤其是口臭和牙周病)的早期篩查和診斷尤為重要。

近年來(lái)，呼氣診斷技術(shù)由于其安全、快捷、低成本的特點(diǎn)，正成為一種越來(lái)越重要的診斷方法，廣泛應(yīng)用在哮喘、肺癌、胃癌、乳腺癌等領(lǐng)域[4]。呼出氣體成分復(fù)雜，包含大量關(guān)于人體健康和疾病的“呼吸印記”，能夠反映當(dāng)前的健康狀況。有研究表明，口腔氣體中含有揮發(fā)性含硫化合物 (volatile sulfur compounds, VSCs)，包括硫化氫 (H2S)、甲硫醇 (CH3SH)、二甲基硫 ((CH3)2S) 等，這些氣體由口腔內(nèi)的微生物，尤其是革蘭陰性厭氧菌分解有機(jī)物后產(chǎn)生，是造成口臭的主要原因[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)揮發(fā)性含硫化合物與口臭、牙周病之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)口臭與牙周炎之間存在正相關(guān)性，硫化物濃度水平能夠反映牙周病的嚴(yán)重程度[6-7]。因此，通過(guò)探究呼出氣中VSCs與口臭、牙周病之間的關(guān)系，利用VSCs來(lái)對(duì)口臭與牙周病進(jìn)行篩查和診斷，可視為一種行之有效的方法。

當(dāng)前，臨床上有許多方法被用于診斷口臭，常用的技術(shù)包括感官測(cè)量、氣相色譜和硫化物傳感器監(jiān)測(cè)等[3]。其中，感官測(cè)量由訓(xùn)練有素的嗅辨員對(duì)口腔異味進(jìn)行感官評(píng)分，是口臭檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 氣相色譜儀能分別測(cè)出H2S、CH3SH、(CH3)2S 等3種揮發(fā)性含硫氣體的具體含量。便攜式硫化物檢測(cè)儀能檢測(cè)VSCs總含量，一般情況下，健康人的檢測(cè)值小于100 ppb。氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC-MS) 通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量化合物的種類和含量，廣泛地應(yīng)用于呼出氣揮發(fā)性有機(jī)化合物 (volatile organic compounds, VOCs) 的檢測(cè)中。但是，由于硫化氫和甲硫醇的揮發(fā)性和反應(yīng)活性強(qiáng)，GC-MS系統(tǒng)難以檢測(cè)到[8]，當(dāng)前利用GC-MS分析口腔氣體的研究較少。

本研究首次建立了利用GC-MS測(cè)量口腔內(nèi)3種硫化物的方法與流程，并研究了GC-MS與便攜式硫化物檢測(cè)儀、便攜式氣相色譜儀之間檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性。檢測(cè)儀只能檢測(cè)氣體含量，無(wú)法為醫(yī)生的臨床診斷提供進(jìn)一步幫助[9]。因此，本研究通過(guò)分析儀器濃度數(shù)值測(cè)量結(jié)果和臨床診斷結(jié)果之間的關(guān)系，確定了不同儀器用于口臭等級(jí)診斷的診斷閾值。進(jìn)一步利用VCSs和年齡、舌苔指數(shù)等多因素，建立了牙周疾病診斷模型，提出可利用呼出氣診斷技術(shù)對(duì)牙周疾病進(jìn)行初步診斷。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采氣過(guò)程所用到的材料有：便攜式硫化物監(jiān)測(cè)儀 (HalimeterTM, Interscan, 美國(guó))，便攜式氣相色譜儀 (Oral ChromaTM, Nissha FIS, 日本)、GCMS-QP 2010 Plus (島津，日本)、一次性特氟龍吹嘴、100 mL Tedlar采氣袋、一次性注射器。采氣袋可重復(fù)利用，每次使用前進(jìn)行老化處理：充入高純氮?dú)夂笤?0℃烘箱中烘干，抽干氣體后待用。每次采樣后進(jìn)行清洗處理：將氣袋內(nèi)的氣體抽干，充入高純氮?dú)猓?0℃下烘干60 min，重復(fù)5次，以保證氣袋處于潔凈狀態(tài)。

1.2 實(shí)驗(yàn)

1.2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院共采集了65名就診者的氣體樣本 (30名男性)，其中健康人17例，厚舌苔18例，牙周病患者 (包括牙齦炎和牙周炎) 30例。所有受試者經(jīng)過(guò)臨床檢查，其中舌苔指數(shù)基于Kojima提出的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]，分為5級(jí)：0級(jí)為無(wú)舌苔，1級(jí)薄舌苔占舌背總面積<1/3，2級(jí)薄舌苔占舌背總面積<1/3～2/3或厚舌苔占1/3，3級(jí)薄舌苔占舌背總面積>2/3或厚舌苔占1/3～2/3，4級(jí)厚舌苔占舌背總面積>2/3，所有樣本的詳細(xì)信息見表1。將年齡劃分為3組：青年組 (年齡<30歲)、中年組 (30≤年齡<50歲) 和老年組 (年齡≥50歲)。采用卡方檢驗(yàn)，比較不同性別、不同年齡組的臨床診斷結(jié)果的差別，不同性別的口臭等級(jí)結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)。結(jié)果表明，不同性別的牙周臨床診斷結(jié)果、口臭等級(jí)均無(wú)顯著性差異 (P>0.05)。因此，在后續(xù)的研究中，不考慮性別這一因素。而不同年齡組的臨床診斷結(jié)果間有顯著性差異 (P<0.05)。因此，在后續(xù)的牙周疾病診斷建模中，將年齡作為影響因素之一。

表1 樣本信息表Tab.1 The information of samples

受試者在測(cè)試前一個(gè)月內(nèi)不能服用抗生素。檢查前24 h內(nèi)禁煙禁酒，避免食用辛辣食物(如大蒜、洋蔥等)。檢查前12 h內(nèi)不應(yīng)清潔或沖洗牙齒，避免使用漱口水、香水。檢查前至少6 h，避免攝入食物或液體。

1.2.2感官評(píng)分

所有受試者均在統(tǒng)一環(huán)境下測(cè)試，由訓(xùn)練有素的嗅辨員進(jìn)行評(píng)分。受試者與嗅辨員之間隔有不透明的屏風(fēng)，受試者在距離嗅辨員10 cm處緩緩呼氣。采用0～5分評(píng)分法[11]對(duì)氣味進(jìn)行等級(jí)量化：0級(jí)代表無(wú)異味，1級(jí)幾乎沒(méi)有明顯的氣味，2級(jí)有輕微的氣味，3級(jí)的氣味中等，4級(jí)有強(qiáng)烈的氣味，5級(jí)代表有極強(qiáng)的氣味，而難以忍受。感官等級(jí)分?jǐn)?shù)越高，表示臭味越強(qiáng)烈。

1.2.3基于便攜式硫化物檢測(cè)儀的口氣檢測(cè)

使用Halimeter對(duì)口腔內(nèi)VSCs總含量進(jìn)行檢測(cè)。被測(cè)前，受試者緊閉嘴唇，采用鼻呼吸，緊閉口腔1 min。測(cè)試時(shí)，將一根連接儀器的吸管深入緊閉的口腔大約2.5～5.0 cm處，待數(shù)值穩(wěn)定后，記錄最高峰的數(shù)值。該過(guò)程重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4基于便攜式氣相色譜儀的口氣檢測(cè)

使用Oral Chroma對(duì)口腔3種硫化物的含量進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)試時(shí)，受試者采用鼻呼吸，并口含一個(gè)1 mL一次性注射器 (無(wú)針頭)，注射器前端深入口腔內(nèi)4～5 cm。1 min后緩慢抽取口腔氣體0.5 mL，并將注射器內(nèi)氣體快速注入儀器中。8 min后讀取儀器測(cè)量結(jié)果。

1.2.5基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的口氣檢測(cè)

成年人每次呼吸會(huì)排出約500 mL氣體，其中前150 mL來(lái)自上呼吸道和鼻咽，后350 mL來(lái)自肺泡[8]。因此，使用100 mL Tedlar采樣袋收集呼出氣樣本，以排除肺泡氣干擾。將一次性特氟龍吹嘴接到采樣袋的出氣口，受試者口含吹嘴30 s后，緩慢打開采樣袋氣密閥。受試者平靜呼吸，向氣袋內(nèi)緩慢吹氣，待收集到100 mL氣體后，迅速關(guān)閉氣密閥，密封保存。

采用GC-MS分析氣袋內(nèi)氣體。使用微量進(jìn)樣針穿透采樣袋的閥門隔墊，伸入氣袋中；拉動(dòng)手柄活塞進(jìn)行抽氣，反復(fù)推拉3次，以保證去除進(jìn)樣針內(nèi)的死腔氣體。抽取1 mL氣體樣本后，迅速轉(zhuǎn)移至GC上進(jìn)行分析。每個(gè)氣袋的樣本重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)用的色譜柱選擇GS-GasPro Columns (30 m×0.32 mm, Agilient)。GC進(jìn)樣口溫度設(shè)置為80℃，進(jìn)樣方式為分流，分流比為4∶1，載氣為純度高于99.999%的高純氦氣。柱箱初始溫度設(shè)置為80℃，以40℃ /min的升溫速率升到220℃，并保持此溫度2 min。MS離子源以70 eV進(jìn)行電子轟擊電離分離化合物，溫度設(shè)置為200℃，接口溫度設(shè)置為250℃，選擇SIM模式進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)離子分別選取硫化氫、二甲基硫、甲硫醇豐度最大的離子，即34、62、47?；谝陨系牟僮鞣椒?，從而建立用于口腔VSCs檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法與流程。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

1.3.1數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)質(zhì)譜庫(kù) (NIST 05和NIST 05 s) 匹配和搜索相似度來(lái)確定3種氣體的保留時(shí)間，相似度超過(guò)90%。圖1為口腔呼出氣體色譜圖，硫化氫、甲硫醇、二甲基硫3種物質(zhì)的保留時(shí)間分別為1.5、2.98、4.92 min。使用島津氣質(zhì)聯(lián)用工作站軟件，對(duì)每個(gè)峰進(jìn)行積分，獲得峰面積。再利用標(biāo)準(zhǔn)樣品外標(biāo)法建立濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)3種氣體進(jìn)行定量。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，可將偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，使樣本數(shù)據(jù)符合參數(shù)統(tǒng)計(jì)如方差分析、t檢驗(yàn)等的假設(shè)前提。對(duì)測(cè)量得到的所有濃度數(shù)值x分別進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換[12]和逆變換，有

圖1 口腔呼出氣體色譜圖(1—硫化氫；2—甲硫醇；3—二甲基硫)Fig.1 Chromatogram of the exhaled breath sample (1—hydrogen sulfide; 2—methyl mercaptan; 3—dimethyl sulfide)

Y=ln(x+c)

(1)

x=eY-c

(2)

式中，c值設(shè)為1。

使用IBM SPSS Statistics 20 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Pearson相關(guān)分析和Spearman相關(guān)分析，比較3種儀器檢測(cè)VSCs濃度的相關(guān)性，并使用單因素方差分析，比較不同口氣等級(jí)的VSCs濃度。

1.3.2ROC曲線分析

在醫(yī)學(xué)研究中，受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic, ROC)常用于判斷生物標(biāo)志物的診斷能力，可以提供診斷的準(zhǔn)確性和最佳閾值點(diǎn)[13]。ROC曲線下面積 (area under the curve, AUC)綜合了靈敏度和特異度，不受決策指標(biāo)的影響，是反映診斷整體準(zhǔn)確性的有效方法。AUC的范圍從0～1，數(shù)值越大，表示診斷能力越好。一般情況下，AUC為0.5，表示無(wú)診斷能力；在0.7～0.8之間診斷價(jià)值中等，被認(rèn)為可以接受；0.8～0.9診斷價(jià)值較高；大于0.9表示診斷價(jià)值極好[14-15]。ROC曲線還能確定最優(yōu)截?cái)嘀?，約登指數(shù)最大化了真陽(yáng)性率和假陽(yáng)性率之間的差異，是一種常用的獲得最佳截?cái)帱c(diǎn)的方法。根據(jù)約登公式[16]獲得約登指數(shù)最大的點(diǎn)作為最佳閾值點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)的敏感度與特異度作為用于診斷的敏感度和特異度，有

約登指數(shù)=敏感度+特異度-1

(3)

將ROC曲線分析用于口臭等級(jí)的氣體濃度閾值確定。每次分析時(shí)，將低于或等于當(dāng)前口臭等級(jí)的樣本設(shè)為陰性，高于的設(shè)為陽(yáng)性。如討論等級(jí)1與等級(jí)2之間的閾值時(shí)，將等級(jí)≤1的樣本設(shè)為陰性，等級(jí)>1的樣本設(shè)為陽(yáng)性，以此類推，進(jìn)行多次ROC曲線分析以確定3個(gè)閾值。

1.3.3牙周疾病診斷模型的建立

近年來(lái)，機(jī)器學(xué)習(xí)方法(如判別分析、邏輯回歸、支持向量機(jī)、分類樹、隨機(jī)森林等)被廣泛用于醫(yī)學(xué)分類問(wèn)題中，作為疾病診斷和檢測(cè)的輔助手段[17-18]。本研究采用線性判別分析、邏輯回歸、貝葉斯優(yōu)化的高斯核支持向量機(jī)，建立牙周疾病診斷模型。

邏輯回歸是一種廣義線性模型，常用于二分類問(wèn)題。該模型構(gòu)建了自變量和因變量之間的多元關(guān)系，通過(guò)模型可以評(píng)估患牙周疾病的后驗(yàn)概率，概率大于0.5則認(rèn)為有牙周疾病。線性判別分析是一種常用的統(tǒng)計(jì)分類方法，它將數(shù)據(jù)投影到另一個(gè)空間，使類內(nèi)距最小的同時(shí)類間距最大，從而達(dá)到不同類別分離的目的。支持向量機(jī)是一種有監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)方法，通過(guò)線性和非線性核將向量映射到高維平面中，并在特征空間尋找最佳超平面，使兩個(gè)類別中的最近點(diǎn)到該超平面的距離最大化，用于線性和非線性數(shù)據(jù)的分類。本研究采用高斯內(nèi)核，它具有兩個(gè)超參數(shù)：懲罰系數(shù)C和核函數(shù)系數(shù)Y。為了獲得這兩個(gè)超參數(shù)的最佳性能，采用貝葉斯方法進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。貝葉斯優(yōu)化方法基于貝葉斯定理，主要由兩部分組成：構(gòu)造一個(gè)目標(biāo)函數(shù)，用于評(píng)估訓(xùn)練過(guò)程；基于先前樣本的后驗(yàn)概率構(gòu)造采集函數(shù)，用于確定下一個(gè)要評(píng)估的點(diǎn)。重復(fù)該過(guò)程，最終確定優(yōu)化后的參數(shù)。

采用ROC曲線分析的方法，分析單一影響因素對(duì)牙周疾病診斷的判別能力。進(jìn)一步以年齡、VSCs濃度、舌苔指數(shù)等影響因素，用3種算法建立納入厚舌苔樣例前后的牙周疾病診斷模型，并采用五折交叉驗(yàn)證評(píng)估診斷模型的性能，包括診斷的準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度、AUC等。需要指出的是，當(dāng)剔除厚舌苔樣本后，健康組的樣本數(shù)量 (17個(gè)) 與牙周疾病組的數(shù)量 (30個(gè)) 不均衡，會(huì)導(dǎo)致診斷模型結(jié)果有誤。因此，在建模前對(duì)健康組樣本進(jìn)行兩倍擴(kuò)充。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)Halimeter、Oral Chroma和GC-MS這3種儀器檢測(cè)到的VSCs對(duì)數(shù)濃度之間進(jìn)行相關(guān)性分析。對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，否則進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。同時(shí)，對(duì)這3種測(cè)試儀器檢測(cè)的VSCs濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行不同口氣等級(jí)間的比較。采用單因素方差分析，并進(jìn)行組間比較。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 儀器的相關(guān)性分析

圖2以GC-MS所測(cè)的VSCs濃度為例，給出了濃度數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)變換前后的分布。如圖2(a)所示，變換前濃度分布范圍較廣，為0～4 000×10-9，由于健康人群的數(shù)值低，大多數(shù)數(shù)據(jù)聚集在低濃度范圍內(nèi)，導(dǎo)致整個(gè)分布呈現(xiàn)正偏態(tài)。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(見圖2(b)) 很好地改善了樣本的正態(tài)性，有助于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖2 對(duì)數(shù)變換前后的GC-MS測(cè)得的VSCs濃度。(a)原始VSCs濃度；(b)對(duì)數(shù)變換后VSCs濃度Fig.2 The concentration of VSCs measured by GC-MS before and after logarithmic transformation. (a) Original VSCs concentration; (b) The VSCs concentration after logarithmic transformation

表2為對(duì)Halimeter、Oral Chroma和GC-MS 這3種儀器檢測(cè)到的VSCs對(duì)數(shù)濃度之間進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果。3種儀器測(cè)量的VSCs總濃度、GC-MS測(cè)得的H2S和CH3SH均為正態(tài)分布，其余對(duì)數(shù)變換后不為正態(tài)分布。對(duì)表2中的前3組數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，其余的進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。3種測(cè)試方式VSCs總濃度均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性 (P<0.01), 其中GC-MS測(cè)得結(jié)果與Halimeter所測(cè)濃度之間的相關(guān)系數(shù)最高，為0.655。Oral Chroma與GC-MS檢測(cè)到的甲硫醇和硫化氫有很好的相關(guān)性 (P<0.01), 但是二甲基硫的檢測(cè)結(jié)果之間不具有顯著相關(guān)性 (P>0.05)。

表2 相關(guān)系數(shù)Tab.2 The correlation coefficient

2.2 口氣等級(jí)與VSCs濃度的相關(guān)性研究

對(duì)3種測(cè)試儀器檢測(cè)的VSCs濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行不同口氣等級(jí)間的比較，其單因素方差分析結(jié)果如圖3所示。3種儀器測(cè)試的VSCs整體濃度隨著口臭等級(jí)的增加而增加。除了Halimeter外，其余兩種儀器測(cè)試結(jié)果顯示，口臭等級(jí)0和等級(jí)1之間有顯著性差異 (P<0.05)。3種儀器在口臭等級(jí)1與等級(jí)2之間有顯著性差異，Halimeter和GC-MS的P值小于0.01，Oral Chroma的P值小于0.05。

圖3 不同口氣等級(jí)的VSCs分布情況 (*代表顯著性差異水平為0.05，**代表顯著性差異水平為0.01)Fig.3 The distribution of VSCs at different organoleptic scale (*represents the significance difference level of 0.05, while ** represents the significance difference level of 0.01)

對(duì)3種儀器VSCs測(cè)試結(jié)果進(jìn)行ROC分析，用于確定等級(jí)診斷閾值，圖4(a)～(c)分別用于區(qū)分口臭等級(jí)0和>0、口臭等級(jí)≤1和>1、口臭等級(jí)≤2和>2。總體而言，利用VSCs判斷診斷閾值的方法是可行的，其ROC曲線均在參考線上方。從圖4(a)看出，當(dāng)區(qū)分口臭等級(jí)0和>0時(shí)，3種儀器的診斷能力基本相同，其ROC曲線較為接近，而圖4(b)和圖4(c)反映了使用Halimeter測(cè)量的VSCs用于判斷口臭等級(jí)≤1和>1、口臭等級(jí)≤2和>2的診斷效果優(yōu)于其他兩種儀器的診斷效果。不同口臭等級(jí)之間的診斷閾值如圖4標(biāo)注所示，其中閾值結(jié)果經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)逆轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換為原始10-9級(jí)濃度值。利用ROC曲線分別獲得的3種儀器對(duì)于口臭等級(jí)的診斷，除了GC-MS在區(qū)分口臭等級(jí)≤2和>2時(shí)其AUC小于0.7，表現(xiàn)出診斷能力稍弱，其余閾值表現(xiàn)出較好的診斷價(jià)值 (AUC>0.7)。其中，Halimeter檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和特異度均大于0.7，其AUC均大于0.8，表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷價(jià)值。Oral Chroma和GC-MS在區(qū)分口臭等級(jí)≤2和>2時(shí)，特異度較低 (<0.7)。

圖4 不同口氣等級(jí)ROC曲線分析結(jié)果(每行上為ROC曲線，曲線中標(biāo)注了最優(yōu)閾值(10-9)及其對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度；下為AUC統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中*代表所得面積與AUC=0.5相比顯著性差異水平為0.05，**代表顯著性差異水平為0.01)。 (a) 區(qū)分口臭等級(jí)0和>0；(b)區(qū)分口臭等級(jí)≤1和>1；(c) 區(qū)分口臭等級(jí)≤2和>2Fig.4 The ROC results of different halitosis levels (The top of each row is the ROC curve, in which the optimal threshold (10-9) and its corresponding sensitivity and specificity are marked. AUC statistical results are shown below, in which * represents the significant difference level of 0.05 compared with AUC=0.5, and ** represents the significant difference level of 0.01). (a) The results of distinguishing halitosis level 0 and >0; (b) The results of distinguishing halitosis level≤1 and > 1; (c) The results of distinguishing halitosis level≤2 and > 2

2.3 牙周疾病的診斷建模

利用ROC曲線計(jì)算GC-MS測(cè)量的氣體濃度，用于診斷牙周疾病的效果(見表3)，兩種氣體對(duì)牙周疾病診斷的曲線下面積均有意義 (P<0.05)，但AUC均小于0.7。因此，單一因素對(duì)牙周疾病的診斷效果不佳。

表3 ROC診斷牙周疾病Tab.3 The result of ROC curve

表4為不同診斷模型5次交叉驗(yàn)證后的結(jié)果。當(dāng)不考慮舌苔因素時(shí)，以年齡、VSCs濃度為參數(shù)建模，3種模型的準(zhǔn)確率均低于0.7。納入舌苔指數(shù)后，3種模型的準(zhǔn)確率及AUC均有所提高，靈敏度和特異度達(dá)到0.7以上，滿足篩查要求。3種模型中，邏輯回歸方法的診斷準(zhǔn)確率最高，達(dá)到75.38%，其AUC也為3種模型中最高。

進(jìn)一步，為了排除厚舌苔組的干擾，只考慮健康組和牙周疾病組 (見表4)。同樣地，分別用3種模型建模，在排除厚舌苔組的干擾后，3種模型的準(zhǔn)確率均有提高，尤其是支持向量機(jī)模型的各項(xiàng)指標(biāo)大幅提高，在有無(wú)舌苔指數(shù)的模型中準(zhǔn)確率均高于90%。由此可見，厚舌苔組對(duì)疾病的診斷產(chǎn)生了一定的干擾，且對(duì)支持向量機(jī)模型的診斷影響最大。

表4 不同模型診斷結(jié)果Tab.4 The result of different models

3 討論

本課題建立了利用GC-MS分析人口腔呼出氣體中硫化物的方法，從結(jié)果上看，與商用儀器結(jié)果顯著相關(guān)，證明了該流程與方法的可靠性。GC-MS作為一種常用的氣體分析儀器，廣泛地應(yīng)用于呼出氣揮發(fā)性有機(jī)化合物VOCs的檢測(cè)中，本研究?jī)H僅對(duì)口腔內(nèi)揮發(fā)性含硫化合物進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明引起口臭的病理原因80%～90%來(lái)源于口腔，仍有10%～20%的非口源性原因，包括了糖尿病患者呼出的丙酮?dú)馕?、腎功能不全患者呼出氨氣氣味等。這些物質(zhì)由血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)椒尾?，并由口鼻呼出。GC-MS能夠有效地檢測(cè)到這些非口源性氣體[8]。本研究通過(guò)控制樣本采集過(guò)程及樣本氣體采集體積，保證所采集氣體來(lái)源于上呼吸道，從而排除其他來(lái)源氣體的干擾。在后續(xù)的研究中，可以進(jìn)一步納入VOCs進(jìn)行檢測(cè)，以更深層次探究和區(qū)分口腔疾病與非口源性疾病。

GC-MS與Oral Chroma兩種方法檢測(cè)到的甲硫醇和硫化氫濃度顯著相關(guān) (P<0.01)，但是二甲基硫不具有顯著相關(guān)性 (P=0.389>0.05)，這與先前的研究一致[8]?？紤]到由于口腔氣體內(nèi)的二甲基硫含量較低，容易產(chǎn)生較大偏差。除此之外，在肝硬化患者中的呼吸和血液中檢測(cè)到高濃度二甲基硫，提示二甲基硫可能是引起口腔外或血源性口臭的主要因素[19]。另外，本研究中GC-MS所檢測(cè)的二甲基硫樣本偏少 (27個(gè)樣本，總樣本為65個(gè))，且大部分樣本結(jié)果為0即低于檢測(cè)閾值，因此需要后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)充樣本以驗(yàn)證該結(jié)論的正確性。

利用ROC模型確定了不同檢測(cè)儀器的口臭等級(jí)閾值，結(jié)果顯示其能夠較好地劃分口臭等級(jí)。由于樣本有限，高于口臭等級(jí)3級(jí)的樣本暫時(shí)未獲取，無(wú)法確定更高口臭等級(jí)診斷閾值。然而，當(dāng)口臭等級(jí)>3時(shí)，口腔異味明顯，患者會(huì)自主就醫(yī)。因此，低等級(jí)口臭的確定和篩查更有意義。一般而言，篩查應(yīng)具有較高靈敏度，以確保真陽(yáng)性結(jié)果，雖然GC-MS在區(qū)分口臭等級(jí)≤2與>2時(shí)的特異度僅為0.5，但其靈敏度達(dá)到了0.895，亦可作為有效篩查。3種儀器檢測(cè)結(jié)果的差異性來(lái)源一是樣本采集方式不同，Halimeter采用的是自動(dòng)進(jìn)樣的方式，而Oral Chroma和GC-MS均采用人工手動(dòng)進(jìn)樣方式，在測(cè)量過(guò)程中有可能引入人為誤差。除此之外，口臭等級(jí)模型中所采用的是硫化物總濃度， Halimeter直接測(cè)量VSCs總含量，而氣相色譜檢測(cè)方式單獨(dú)測(cè)量每種氣體的含量，引入偏差。

牙周疾病與性別無(wú)關(guān)，而年齡是一個(gè)重要的影響因素，與Miyazaki的研究結(jié)果相符[20]。納入舌苔指數(shù)因素后及剔除厚舌苔組的樣本后，模型的準(zhǔn)確率均有提高，因此舌苔也是診斷口腔疾病一個(gè)重要的影響因素。有研究認(rèn)為，舌頭具有較大的乳頭狀表面積，保留了大量的微生物和脫落的細(xì)胞，舌苔是硫化物的主要來(lái)源。舌頭上的革蘭氏陰性菌降解口腔中的半胱氨酸和蛋氨酸等含硫底物，產(chǎn)生VSCs。相比于健康者，口臭嚴(yán)重患者的舌上細(xì)菌密度和細(xì)菌種類明顯增加[21]。舌苔的厚度還與年齡有關(guān)，這可能與隨著年齡增大，唾液流量減少，唾液性質(zhì)改變以及唾液對(duì)舌頭的自然清潔減少有關(guān)[22-23]。

另外，由于門診就診患者的隨機(jī)性，本研究中口臭等級(jí)為0的健康人的樣本數(shù)偏少。除此之外，不同性別、年齡個(gè)體由于就診意圖不一致，會(huì)引入諸如性別、年齡等因素上的差異。為了進(jìn)一步建立更加準(zhǔn)確的診斷模型，需要人為控制不同口臭等級(jí)、不同口腔疾病的樣本數(shù)量，并需要繼續(xù)擴(kuò)充樣本量。

4 結(jié)論

本研究首次建立了利用GC-MS檢測(cè)口腔內(nèi)揮發(fā)性硫化物的方法與流程，與臨床所用儀器測(cè)試結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，并建立了口臭等級(jí)閾值診斷模型和牙周疾病診斷模型，其靈敏度均大于0.7，證明了所提出的基于口腔揮發(fā)性含硫氣體標(biāo)志物診斷口臭和牙周疾病方法能初步實(shí)現(xiàn)口腔疾病的篩查，用于輔助臨床診斷。下一步，納入更多VOCs標(biāo)志物和呼出氣體冷凝物 (exhaled breath condensate, EBC) 等，實(shí)現(xiàn)更多疾病的綜合篩查與診斷。基于呼出氣體標(biāo)志物的疾病篩查與診斷技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面有極大的前景，需要進(jìn)行進(jìn)一步探索和研究。