朱嚴(yán)華，楊 波，黃 菊,2, ，張 帥，余新威，祝世超，唐云平

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316000；2.浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316000；3.浙江省舟山疾病預(yù)防與控制中心，浙江舟山 316000）

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）又稱多環(huán)性芳香化合物或多環(huán)芳香族碳?xì)浠衔颷1]，這類有機(jī)物種類較多，分布較廣，與人類密切相關(guān)，具有致癌、致畸、致突變等毒副作用，極大地威脅著人類的健康。在飲用水、蔬菜、水果、谷類、油類、奶制品和煙熏肉等食品[2?5]中均檢測(cè)出多環(huán)芳烴（PAHs），其中在果蔬中含量較少[6]。烤鴨、烤腸等經(jīng)過烤、炸、煎等加工處理的食品中多環(huán)芳烴含量普遍高于國(guó)內(nèi)、國(guó)際最高限量標(biāo)準(zhǔn)[7?8]。

目前，針對(duì)土壤、空氣、水，以及蔬菜瓜果等中多環(huán)芳烴的檢測(cè)已經(jīng)建立了簡(jiǎn)便高效的方法[9?12]，研究表明肌肉類食物（如水產(chǎn)品和肉類）中富含肌酸、肌酸酐、氨基酸等物質(zhì)，在高溫條件易分解或者與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致大量多環(huán)芳烴等有害物質(zhì)的形成[13]，肉及肉制品基質(zhì)高度復(fù)雜，通常需要大量的凈化提取程序以破壞其脂質(zhì)組分并促進(jìn)目標(biāo)分析物的提取，因此它們的前處理比其他食品樣品的預(yù)處理更加困難[14?16]。因此，在不同基質(zhì)基礎(chǔ)上建立的檢測(cè)方法對(duì)加工食物中多環(huán)芳烴的檢測(cè)具有一定的局限性。通常多環(huán)芳烴的分析檢測(cè)主要分為預(yù)處理與測(cè)定兩部分，預(yù)處理包括提取、純化、富集。常用的提取方法多種多樣，主要有索氏萃取、加速溶劑萃取、微波輔助萃取、超臨界流體萃取、固相微萃取、超聲萃取[17?19]等。多種提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中超聲提取是指利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化應(yīng)效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、高的加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取進(jìn)行的萃取方法，其具有操作簡(jiǎn)單、溶劑使用量少、提取效果穩(wěn)定和耗時(shí)短的特點(diǎn)，是從土壤等基質(zhì)中提取多環(huán)芳烴的一個(gè)重要提取方法[20]。多環(huán)芳烴的測(cè)定技術(shù)較為成熟，主要有高效液相色譜（HPLC-DAD）、液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）、氣相色譜（GC-FID）以及氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）等方法。與液相色譜相比，氣質(zhì)聯(lián)用法可以提供足夠的化合物定性分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)靈敏度高。本實(shí)驗(yàn)以煎烤魷魚為研究對(duì)象，擬通過前處理?xiàng)l件優(yōu)化，采用超聲萃取聯(lián)合氣象色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）探索煎烤類食品中多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法，同時(shí)也為進(jìn)一步研究煎烤類食品中多環(huán)芳烴形成規(guī)律及控制方法打下良好的檢測(cè)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮秘魯魷魚（250±10 g） 采購(gòu)于舟山新城華潤(rùn)萬(wàn)家超市；煎烤魷魚（成品）樣品1、2、3采購(gòu)于舟山新城華潤(rùn)萬(wàn)家超市；煎烤魷魚（成品）樣品4、5、6采購(gòu)于舟山華之友超市；正己烷、二氯甲烷 色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硅膠（70～230目）、堿性氧化鋁（0.05～0.15 mm） 美國(guó)Fluka公司；PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)液 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；16種氘代多環(huán)芳烴同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液 德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司；無(wú)水硫酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)。

尚康磨粉機(jī)（FL1936） 溫州福菱科技有限公司；超聲波清洗器（KQ5200DA） 昆山市超聲儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)（FD-1D-50） 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Avanti JXN-30）美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；氮吹儀（NEVAP-24）濟(jì)南正榮醫(yī)療器械有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890B/7000D） 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煎烤魷魚制備 將冷凍魷魚流水解凍后，三去處理（去頭去鰭去內(nèi)臟），清水洗干凈，取厚度為2 mm部位切成大小為5 cm×5 cm魷魚片。160±2℃條件下，將魷魚置于平底鍋煎制（棕櫚油），翻面防止變糊，直至魷魚熟透（3 min）。煎烤完成后用吸油紙吸除多余的油脂，勻質(zhì)化處理后?80℃冷凍保存，樣品待分析。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.00 g（精確至0.01 g）樣品，加入25 mL正己烷、100μL 100μg/mL多環(huán)芳烴氘代內(nèi)標(biāo)和100μL 100μg/mL多環(huán)芳烴外標(biāo)，渦旋混勻后30℃超聲20 min，4℃條件下8000 r/min離心10 min，吸取上層清液，下層加入20 mL正己烷復(fù)提一次，合并兩次上清液待凈化。采用堿性氧化鋁/硅膠色譜法做凈化分離[21]。轉(zhuǎn)換溶劑后用正己烷定容至1.0 mL后過0.45μm濾膜待檢測(cè)。

1.2.3 提取條件優(yōu)化

1.2.3.1 除水對(duì)回收率的影響 為考察樣品中水分對(duì)多環(huán)芳烴提取的影響，實(shí)驗(yàn)組采用冷凍干燥處理煎烤魷魚，對(duì)照組不做處理，按照1.2.2方法進(jìn)行提取凈化，1.2.4進(jìn)行測(cè)定，以多環(huán)芳烴加標(biāo)回收率為指標(biāo)，確定最佳提取條件。

1.2.3.2 提取溶劑對(duì)回收率的影響 通常用于提取生物樣品中PAHs的溶劑有乙腈、正己烷、二氯甲烷、丙酮、苯及其混合溶液[22?25]。為了達(dá)到提取效率最大化、綠色環(huán)保的目的，考察了常用試劑正己烷、二氯甲烷與4種不同體積比的正己烷-二氯甲烷混合溶劑（4:1、3:1、2:1、1:1）的提取效果，按照1.2.2方法進(jìn)行提取凈化，1.2.4進(jìn)行測(cè)定，以多環(huán)芳烴加標(biāo)回收率為指標(biāo)，確定最佳提取條件。

1.2.3.3 提取溶劑用量對(duì)回收率的影響 以最佳提取溶劑為提取試劑，考察了不同提取體積（15、20、25、30 mL）對(duì)回收率的影響，按照1.2.2方法進(jìn)行提取凈化，1.2.4進(jìn)行測(cè)定，以多環(huán)芳烴加標(biāo)回收率為指標(biāo)，確定最佳提取條件。

1.2.3.4 提取溫度對(duì)回收率的影響 以最佳提取溶劑為提取試劑，以最佳提取溶劑用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察了不同溫度（20、30、40、50℃）對(duì)回收率的影響，按照1.2.2方法進(jìn)行提取凈化，1.2.4進(jìn)行測(cè)定，以多環(huán)芳烴加標(biāo)回收率為指標(biāo)，確定最佳提取條件。

1.2.4 色譜條件

1.2.4.1 GC條件 色譜柱：VF-5ms色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：60℃保持1 min，以10℃/min升至210℃，再以1.5℃/min升至260℃，然后以3℃/min升至290℃；載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.2μL。分流方式：不分流。

1.2.4.2 MS條件EI源：230℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度：280℃；離子阱溫度：200℃；電子倍增管電壓：1650 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z：40～290。16種多環(huán)芳烴及其氘代內(nèi)標(biāo)的SIM離子見表1，以信噪比（S/N）為3計(jì)算檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為7計(jì)算定量限（LOQ）。

表1 16種多環(huán)芳烴及其氘代物SIM離子及理化性質(zhì)Table 1 SIM ion and physicochemical propertiesof 16 polycyclic aromatic hydrocarbons and their deuterium substitutes

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0、SPSS19.0軟件作圖及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 除水優(yōu)化

魷魚經(jīng)煎烤處理后仍然含有70%～75%水分，且經(jīng)過煎烤處理后含有部分油脂，在提取過程中會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。而多環(huán)芳烴是脂溶性物質(zhì)，乳化層可能存在目標(biāo)物，為減少乳化現(xiàn)象的發(fā)生，提高提取效率，采用冷凍干燥處理后加入100μL 100μg/mL多環(huán)芳烴外標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示（見圖1），實(shí)驗(yàn)組采用冷凍干燥處理后，萘、芴、菲、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、茚并[1，2，3-cd]芘、二苯并[a，h]蒽的回收率均得到了提升，且其他組分回收率均得到較好保持，實(shí)驗(yàn)組回收率為66.95%～141.43%，對(duì)照組回收率為61.31%～137.38%。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥對(duì)低環(huán)、低分子量多環(huán)芳烴影響較大，可能是低環(huán)多環(huán)芳烴的物理性質(zhì)所決定，隨著多環(huán)芳烴環(huán)數(shù)的增加，分子量的增加，多環(huán)芳烴的溶解度（25℃）逐漸下降，水分的去除對(duì)于提取低環(huán)多環(huán)芳烴具有一定的促進(jìn)作用，但由于低環(huán)多環(huán)芳烴的沸點(diǎn)更低，更易揮發(fā)，冷凍干燥的同時(shí)也加劇了低環(huán)多環(huán)芳烴的揮發(fā)，又降低了低環(huán)多環(huán)芳烴的提取效率；高環(huán)芳烴由于其強(qiáng)疏水性，高沸點(diǎn)，冷凍干燥對(duì)其的影響并不大[26]。冷凍干燥處理后，能夠完全控制乳化現(xiàn)象的發(fā)生，降低乳化對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，提高了低環(huán)多環(huán)芳烴萘的提取效率，且其他種類的多環(huán)芳烴回收率亦在可接受范圍之中，故實(shí)驗(yàn)采用除水優(yōu)化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 除水優(yōu)化后16種多環(huán)芳烴回收率Fig.1 Recovery rates of 16 PAHs after water removal optimization

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑種類的選擇 正己烷-二氯甲烷混合溶液的極性隨著二氯甲烷比例的升高而增加，而PAHs中稠環(huán)組分具有一定極性，根據(jù)相似相溶原理，增大溶劑中的二氯甲烷比例，可更容易提取極性較大的稠環(huán)組分。由表2可知，提取試劑為正己烷時(shí)，總體回收率為75.88%～132.27%；提取試劑為正己烷:二氯甲烷=4:1時(shí)，總體回收率為66.41%～120.19%；提取試劑為正己烷:二氯甲烷=3:1時(shí)，總體回收率為60.28%～123.68%；提取試劑為正己烷:二氯甲烷=2:1時(shí)，總體回收率為56.18%～114.91%；提取試劑為正己烷:二氯甲烷=1:1時(shí)，總體回收率為72.69%～146.22%；提取試劑為二氯甲烷時(shí)，總體回收率為56.43%～132.13%。從各組分回收率來(lái)看，使用正己烷提取，平均回收率較好，達(dá)到109.62%，可能是受基質(zhì)的影響，煎烤魷魚中含有少量油脂，外標(biāo)加入混合后首先溶于脂質(zhì)中，而正己烷與脂質(zhì)互溶，能夠更好的進(jìn)行提取。雖然苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽等高環(huán)芳烴在混合提取試劑中隨著極性的增強(qiáng)，回收率有所增加，但總體回收率與正己烷為提取劑相比，并不高，可能是因?yàn)榛旌先軇┨崛r(shí)，最終需要進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換，在轉(zhuǎn)換的過程中導(dǎo)致多環(huán)芳烴少量揮發(fā)，從而降低了回收率。考慮到實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便性及各組分回收率，采用正己烷提取操作簡(jiǎn)便，且正己烷對(duì)16種PAHs的回收率均較理想（75.88%～132.27%），因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇正己烷為最佳提取溶劑。

表2 不同試劑提取下各組分回收率Table 2 Recovery ratesof each component extracted by different reagents

2.2.2 提取溶劑用量的選擇 以正己烷溶液為提取試劑，不同劑量下回收率如表3，提取溶劑用量為15 mL時(shí)，16種PAHs回收率為61.31%～137.38%；提取溶劑用量為20 mL時(shí)，16種PAHs的回收率為75.88%～132.27%；提取溶劑用量為25 mL時(shí)，16種PAHs的回收率為82.69%～134.33%；提取溶劑用量為30 mL時(shí)，16種PAHs回收率為74.49%～133.31%。15、20、25、30 mL正己烷對(duì)16種PAHs的回收率范圍較為接近，但使用25 mL正己烷提取時(shí)，對(duì)低環(huán)多環(huán)芳烴如萘等提取效果更佳，因此，實(shí)驗(yàn)選擇提取溶劑的最佳用量為25 mL。

表3 不同劑量提取下各組分回收率Table 3 Recovery rates of each component were obtained at different doses

2.2.3 提取溫度的選擇 不同提取溫度下回收率如表4，提取溫度為20℃時(shí)，16種PAHs回收率為82.69%～134.33%；提取溫度為30℃時(shí)，16種PAHs回收率為96.26%～132.39%；提取溫度為40℃時(shí)，16種PAHs回收率為104.07%～136.48%；提取溫度為50℃時(shí)，16種PAHs回收率為95.79%～135.46%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溫度的變化對(duì)實(shí)驗(yàn)回收率的影響并不大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇提取最佳溫度為最接近室溫的30℃。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果都呈現(xiàn)出低環(huán)PAHs的回收率低于高環(huán)PAHs。研究表明，低環(huán)PAHs（如萘、苊、苊烯、芴等）在濃縮過程中更易轉(zhuǎn)移到空氣中，因此有不同程度的損失[27]。

表4 不同溫度提取下各組分回收率Table 4 Recovery rates of each component were obtained at different temperatures

2.3 方法的線性范圍與檢出限

用正己烷配制成16種PAHs質(zhì)量濃度分別為0.001、0.002、0.010、0.020、0.100μg/L和含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.010μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述優(yōu)化色譜條件下進(jìn)行分析。以目標(biāo)物與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物的定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。以信噪比（S/N）為3計(jì)算檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為7計(jì)算定量限（LOQ）。結(jié)果表明，16種PAHs在0.001～0.100μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r）不低于0.9994，16種PAHs的檢出限范圍為0.09～0.52μg/kg，定量限范圍為0.21～1.21μg/kg。方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表5。

表5 16種多環(huán)芳烴的線性方程及方法檢出限、定量限Table 5 Standard curves,LODSand LOQs for 16 PAHs

2.4 方法的回收率與精密度

添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表6。由表6可知，煎烤魷魚樣品在1、2、20μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率分別為73.98%～128.17%、73.21%～133.24%、76.35%～133.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為1.32%～2.98%、0.93%～2.47%、1.08%～2.87%，符合污染物殘留分析方法的準(zhǔn)確的和精密度要求。

表6 16種多環(huán)芳烴的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 6 Average standard recovery and relative standard deviation of 16 PAHs(n =6)

2.5 魷魚經(jīng)加工后多環(huán)芳烴變化

將魷魚樣品在160±2℃條件下煎烤3 min，然后檢測(cè)樣品多環(huán)芳烴總量以及16種常見多環(huán)芳烴化合物的含量。結(jié)果如圖2所示：經(jīng)過3 min的加工處理，萘、苊烯、苊、芴、菲、熒蒽、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘含量均有所上升，蒽、芘、茚并[1，2，3-cd]蒽、二苯并[a,h]蒽含量有所下降，實(shí)驗(yàn)組多環(huán)芳烴總含量較對(duì)照組（生鮮魷魚）有顯著增加，達(dá)到了33.44μg/kg，而對(duì)照組（生魷魚）中含量為19.46μg/kg，增長(zhǎng)率為71.84%。魷魚在加工過程由外至內(nèi)溫度逐漸升高，內(nèi)部溫度越高，蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)裂解、環(huán)化、聚合成多環(huán)芳烴的程度也加深，進(jìn)而導(dǎo)致多環(huán)芳烴總量的增加[28]。

圖2 煎烤前后16種多環(huán)芳烴含量變化Fig.2 Content of 16 kindsof PAHsvaried beforeand after frying and baking

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用該方法對(duì)來(lái)自舟山超市等共6地所采的煎烤魷魚共計(jì)6份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，煎烤魷魚中多環(huán)芳烴均有不同程度地檢出，多環(huán)芳烴總量20.29～73.96μg/kg不等。致癌性化合物如苊烯、芴、蒽、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[g,h,i]苝未檢出，但苯并[a]芘均有檢出，其中樣品1、樣品2中苯并[a]芘含量超過了中國(guó)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2017對(duì)肉類產(chǎn)品中苯并芘的限量5.0μg/kg[29]，應(yīng)引起重視。各樣品中多環(huán)芳烴含量多變，可能與其煎烤時(shí)間，煎烤使用香料種類等有關(guān)。

表7 實(shí)驗(yàn)樣品中多環(huán)芳烴的檢測(cè)結(jié)果（μg/kg）Table 7 Determination of PAHs in actual samples(μg/kg)

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了煎烤魷魚中16種PAHs的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)冷凍干燥后，25 mL正己烷、30℃超聲提取兩次，濃縮后經(jīng)堿性氧化鋁和硅膠復(fù)合固相萃取柱凈化，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，多環(huán)芳烴氘代內(nèi)標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了煎烤食品中16種PAHs含量的定量及確證分析。該方法16種PAHs的檢出限范圍為0.09～0.52μg/kg，定量限范圍為0.21～1.21μg/kg。在1、2、20μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率分別為73.98%～128.17%、73.21%～133.24%、76.35%～133.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為1.32%～2.98%、0.93%～2.47%、1.08%～2.87%。符合污染物殘留分析方法的準(zhǔn)確的和精密度要求。在實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用中，亦有較好表現(xiàn)。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足檢測(cè)分析的要求，為食品安全領(lǐng)域提供重要的技術(shù)支持。