喻 嘉，王易明

（1. 湖南百舸水利建設(shè)股份有限公司，湖南 長沙 410007；2. 湖南百舸水利邵陽縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)污水處理項目部，湖南 邵陽 422100）

前 言

厭氧氨氧化（Anammox），是指自養(yǎng)細(xì)菌在氧氣限制條件下將氨氧化與亞硝酸鹽還原耦合產(chǎn)生氮氣（N2）的過程[1～2]。厭氧氨氧化的發(fā)現(xiàn)及其在污水處理上的應(yīng)用給傳統(tǒng)的廢水脫氮帶來了革命性的變化[3]。

大量研究證實了厭氧氨氧化在自然生態(tài)系統(tǒng)和人工生態(tài)系統(tǒng)中對脫氮的重要作用。過去十年的研究發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化工藝在廢水生物處理系統(tǒng)中不僅有利于去除氨氮，而且還能節(jié)約碳源和能源。目前已經(jīng)開發(fā)了許多污水處理技術(shù)工藝，可以最大限度地利用厭氧氨氧化處理高濃度氨氮廢水。與傳統(tǒng)的脫氮工藝相比，厭氧氨氧化工藝具有許多優(yōu)點，例如不需要利用溶解氧從而節(jié)省能源成本， 除此之外還可以減少溫室氣體釋放，如N2O[2，4]。由于這些特點，厭氧氨氧化工藝已在實驗室模擬和實際應(yīng)用中用于處理各種類型的高氮廢水，如豬場廢水、制革廢水和垃圾滲濾液等[5～7]。

厭氧氨氧化因其過程耗氧量低、對有機(jī)碳的需求量少而被廣泛應(yīng)用于高濃度氨氮廢水處理[8～9]。為了維持生物廢水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定的厭氧氨氧化過程，必須提高微生物的穩(wěn)定性、多樣性和活性，為此要了解污水處理廠活性污泥中厭氧氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動因素，因此本文采集了8 個污水處理廠的活性污泥樣品，對其厭氧氨氧化的功能基因豐度、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及驅(qū)動因素進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與環(huán)境因子測定

本文選取了8 個污水處理廠的活性污泥樣品進(jìn)行分析。樣品氨氮（NH4+-N），硝氮（NO3--N）和亞硝氮（NO2--N）濃度利用流動分析儀測定。pH 值利用pH 測定儀測定?？偟═N）、總碳（TC）和總硫（TS）濃度利用元素分析儀測定。

1.2 DNA 提取與qPCR 定量

選取8 個污水處理廠的活性污泥樣品進(jìn)行分析。將樣品凍干后研磨過篩，使用Mobio 試劑盒提取土壤樣品中的DNA（PowerSoil RDNA Isolation Kit，美國）。使用引物HSBeta396F（ARGGHTGGGGHAGYTGGAAG）和HSBeta 742R（GTYCCHACRTCATGVGTCTG）對厭氧氨氧化功能基因hzsB 利用熒光定量PCR 技術(shù)測定，獲得厭氧氨氧化的絕對豐度。

1.3 高通量測序與處理

利用PCR 技術(shù)從DNA 提取物中擴(kuò)增出hzsB 功能基因。經(jīng)過純化后在Illumina MiSeq 2500 平臺上進(jìn)行高通量測序。測序得到的hzsB 序列經(jīng)過質(zhì)控處理后，使用QIIMEM 等軟件處理高通量序列，將處理后序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白序列比對注釋，得到厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文中斯皮爾曼相關(guān)性分析用于處理厭氧氨氧化豐度與理化因子的相關(guān)性， 單因素方差分析用于處理不同樣品之間參數(shù)的差異性，R 和Gephi 軟件用于網(wǎng)絡(luò)圖的處理與分析，主坐標(biāo)分析（PCOA）用于分析不同樣品間厭氧氨氧化細(xì)菌群落的相似性和差異性。

2 研究結(jié)果與討論

2.1 理化結(jié)果

對8 個污水處理廠的活性污泥樣品的理化因子進(jìn)行分析，如表1 顯示，氨氮（NH4+-N）濃度在所有樣品中差異性不大（p>0.05），在20.65～31.60 mg/L 范圍內(nèi)，而硝氮（NO3--N）濃度跟NH4+-N 濃度相比起來，處于較低的水平，在4.03～15.87 mg/L 范圍內(nèi)；亞硝氮（NO2--N）的濃度也較低，均在1 mg/L 以下，最低為0.12 mg/L?？偟═N）濃度在不同活性污泥樣品中變化差異性較大（p<0.05），總體濃度在0.39～4.89 g/L 范圍內(nèi)，而總碳（TC）的濃度大于總氮，不同樣品間變化差異也大，最大可達(dá)73.93 g/L。pH 范圍在3.47～7.9 之間。以上結(jié)果說明，不同污水處理廠之間的活性污泥的理化性質(zhì)具有差異性，這可能與各個污水處理廠污水處理的參數(shù)等有關(guān)。

2.2 厭氧氨氧化定量

針對厭氧氨氧化細(xì)菌的hzsB 功能基因?qū)? 個污水處理廠活性污泥樣品的DNA 進(jìn)行熒光定量PCR 實驗，結(jié)果顯示如圖1，厭氧氨氧化豐度變化差異性較大（p<0.05），在3.53±0.05×1010到2.51±0.01×1011copies/g VSS 范圍內(nèi)。豐度范圍與其他污水處理廠相似[10，11]。E污水處理廠含有最大豐度的厭氧氨氧化豐度（2.51±0.01×1011copies/g VSS），而C 樣點含量最低（3.53±0.05×1010copies/g VSS）。斯皮爾曼相關(guān)性結(jié)果顯示，NH4+-N（p=0.002）和NO2--N（p<0.001）與豐度具有顯著正相關(guān)關(guān)系。NH4+-N 和NO2--N 作為厭氧氨氧化反應(yīng)的底物，其濃度的增加必然會增加其豐度，這與以往的結(jié)果相似[10]。

圖1 不同污水處理廠中活性污泥中厭氧氨氧化功能基因豐度

2.3 厭氧氨氧化細(xì)菌組成和多樣性

為了了解不同污水處理廠活性污泥樣品中厭氧氨氧化細(xì)菌群落組成和變化，我們做了基于hzsB 功能基因的高通量測序技術(shù)實驗，結(jié)果共注釋到5 種厭氧氨氧化細(xì)菌種屬，分別為Candidatus Brocadia sp.a，Candidatus Brocadia sp.f，Candidatus Jettenia sp.J，Candidatus Kuenenia sp.K 和Candidatus Scalindua sp.S。總體來說，OTUs 數(shù)量最多的是屬于Ca.Brocadia,平均OTUs 數(shù)為69 256，顯著高于其他種屬（p<0.05）。

對厭氧氨氧化的多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同污水處理廠之間的活性污泥樣品中厭氧氨氧化細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)差異性較大（p<0.05），如表2所示。與豐度結(jié)果類似，E 點的超（183.8），辛普森（0.91）和香農(nóng)（3.01）指數(shù)都較大，然而多樣性最小的點是H點，表明H 污水廠內(nèi)厭氧氨氧化群落的均勻度較差。相關(guān)性結(jié)果顯示，NH4+-N（p=0.002）與α 多樣性指數(shù)具有顯著正相關(guān)關(guān)系，這也說明NH4+-N 有利于增加厭氧氨氧化細(xì)菌的多樣性。

表2 不同污水處理廠中活性污泥中厭氧氨氧化細(xì)菌的α 多樣性指數(shù)

對厭氧氨氧化細(xì)菌群落的β 多樣性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，兩軸對細(xì)菌群落的解釋度分別為55.1%和23.4%，總體解釋度大于70%（圖2）。污水處理廠A 與D 的厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，而C 和B，E 和F，G和H 的群落結(jié)構(gòu)更為相似，四組之間差異性較大，這可能說明污水處理廠相似的運(yùn)行模式下，活性污泥中厭氧氨氧化的群落結(jié)構(gòu)也會更加相似。

圖2 不同污水處理廠中活性污泥中厭氧氨氧化細(xì)菌的群落PCoA 圖

2.4 厭氧氨氧化細(xì)菌群落間相互作用

為了了解活性污泥中厭氧氨氧化群落結(jié)構(gòu)的相互作用，利用網(wǎng)絡(luò)圖做進(jìn)一步分析。選取數(shù)量占比前200的OTUs 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖分析，保證相關(guān)性系數(shù)大于0.8 且顯著性p值小于0.05 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3 顯示，主要分類到5 個模塊，這些模塊的節(jié)點數(shù)目占總節(jié)點的比例大于90%?？傮w來說厭氧氨氧化細(xì)菌群落相互作用密切，模塊化指數(shù)為0.601，而且不同模塊之間連接緊密，離散的節(jié)點數(shù)較少。整個網(wǎng)絡(luò)圖中Candidatus Brocadia sp. 是關(guān)鍵菌屬，與其連接的節(jié)點數(shù)達(dá)到53個，但是不同模塊中的關(guān)鍵菌屬也具有差異，例如模塊5 的關(guān)鍵菌屬是Candidatus Jettenia sp.，而模塊2 中關(guān)鍵菌屬是Candidatus Kuenenia sp.，這可能說明在活性污泥中厭氧氨氧化各個菌屬都發(fā)揮作用，但是菌種之間具有一定協(xié)同和競爭作用。以往研究對污水處理廠活性污泥絮體的研究表明，厭氧氨氧化菌多樣性較低，然而Candidatus Brocadia 是絕對優(yōu)勢物種[11]，與本文研究相似。除此之外，對處理高氨氮廢水（如垃圾滲濾液）時所用到的絮凝污泥和顆粒生物膜樣品中微生物多樣性分析表明，Candidatus Brocadia 在厭氧氨氧化菌群落中也占據(jù)主導(dǎo)地位[12～13]。然而在處理低氨生活廢水時，Candidatus Jettenia 和Candidatus Kuenenia 卻是優(yōu)勢物種。

圖3 不同污水處理廠活性污泥中厭氧氨氧化細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

3 結(jié) 論

本文研究中選取了8 個不同污水處理廠的活性污泥樣品，研究了厭氧氨氧化的豐度、細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動因素，結(jié)果顯示厭氧氨氧化的豐度水平較高，可達(dá)1011copies/g VSS，且不同樣品間豐度分布差異性較大，厭氧氨氧化的多樣性變化也較大，而氨氮濃度是這些差異的主要驅(qū)動因素。氨氮與厭氧氨氧化的豐度和多樣性具有顯著正相關(guān)關(guān)系，說明高氨氮廢水更有利于富集厭氧氨氧化。除此之外，厭氧氨氧化細(xì)菌的群落相互作用較為密切，且Candidatus Brocadia 是優(yōu)勢菌屬，主導(dǎo)厭氧氨氧化反應(yīng)過程。以上結(jié)果多方面研究了不同污水處理廠活性污泥中厭氧氨氧化細(xì)菌賦存現(xiàn)狀和其影響因素，對提高厭氧氨氧化微生物在污水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性、多樣性和活性具有參考意義。