金智偉，楊維雄，尹建華，王軍民，嚴毅*

響應曲面法優(yōu)化白及揮發(fā)性成分提取工藝

金智偉，楊維雄，尹建華，王軍民，嚴毅

(1. 昆明市海口林場，云南 昆明 650114； 2. 西南林業(yè)大學西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224)

以提取率作為響應值，在單因素試驗的基礎上采用響應曲面法研究提取粉碎粒度、壓力、溫度三個因素對白及揮發(fā)油提取效果的影響，確定揮發(fā)油最佳提取工藝；運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對其主要化學成分進行鑒定。結(jié)果表明：粉碎粒度、提取壓力、提取溫度分別為50目、27 MPa、50℃時，提取率達到最大(1.28%)；通過NIST14質(zhì)譜庫檢索，鑒定白及揮發(fā)油中匹配度大于85的72種可能物質(zhì)，運用峰面積歸一法確定各個組分的相對含量，鑒定物質(zhì)占揮發(fā)油總量的92%。

白及；揮發(fā)油；二氧化碳超臨界；提取工藝；響應曲面法

白及是蘭科植物白及()的干燥塊莖。每年9—10月地上部分枯萎時采挖，采挖后洗凈，除雜，蒸透至無白心后曬至半干，除去外皮切片曬干，得到白及藥材飲片。白及廣泛分布在包括中國在內(nèi)的東亞國家，朝鮮、日本和緬甸。該植物為古代中國傳統(tǒng)中藥“七白”之一，我國主要分布在于云南、貴州、四川、湖南、秦嶺、長江中下游地區(qū)。中醫(yī)認為白及性苦、澀、溫，在消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、瘀傷、燒傷等方面具有獨到的生物活性。文獻報道白及的主要化學成包括以下幾類：聯(lián)芐類、菲類及其衍生物、白及甘露聚糖、淀粉以及少量的粘液質(zhì)等，關于白及揮發(fā)油提取工藝和成分尚未見報道。

為進一步研究和開發(fā)白及的價值并補充白及化學成分研究，本實驗優(yōu)化二氧化碳超臨界最佳提取工藝提取白及揮發(fā)油，對其進行主成分分析，為研究和開發(fā)利用傳統(tǒng)中藥材白及提供實驗依據(jù)和研究基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

白及原材料采于昆明?？诹謭觯蜏睾娓珊蠓鬯椴煌繑?shù)過篩備用。

1.2 實驗儀器與試劑

二氧化碳超臨界設備(美國ASI)；Agilent 7890A-5975B型氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph Digital)；超聲波清洗器(BK-300 GDE)；移液槍、容量瓶、樣品瓶等；無水乙醇為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 超臨界提取揮發(fā)油

稱取100 g粉碎后白及樣品進行單因素試驗分析，本實驗采用了單因素控制變量的試驗方式，萃取壓力分別設為10、15、20、25、30、35 MPa共6個水平；萃取溫度分別設為 30、35、40、45、50、55、60 ℃ 7個水平；白及粉碎粒度分別為5、10、20、40、60、80目6個水平。對3個方面因素進行研究。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇合適的萃取壓力、萃取溫度、藥材粉碎粒度3個因素為研究對象，按照3因素3水平進行Box-Behnken 中心組合設計試驗，因素與水平編碼如表1 所示。

表1 因素與水平編碼

1.3.2 揮發(fā)油主成分分析

GC條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm)；柱溫：80～220℃，程序升溫5℃·min；柱流量1.0 ml·min；進樣口溫度250℃；柱前壓100 kPa；進樣量0.1 μl；不分流；載氣為高純氦氣。MS條件：電離方式EI；質(zhì)量范圍：35～500；采用NIST14質(zhì)譜庫檢索計算機定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界提取揮發(fā)油

2.1.1 單因素考察

二氧化碳超臨界提取壓力對白及揮發(fā)油提取率的影響：設定萃取釜溫度為50℃時提取碎粒度20目的白及粉，變換提取壓力。當壓力分別在10、15、20、25、30、35 MPa條件下，二氧化碳超臨界提取白及揮發(fā)油的得率分別為2.1、4.6、7.1、10.3、9.4、10.1 mg·g。由試驗結(jié)果可知當提取壓力高于25 MPa時白及揮發(fā)油的提取率達到一個峰值，隨提取壓力的升高提取率呈波動趨勢，分析其產(chǎn)生原因可能是高壓下CO密度較大，而液體狀態(tài)下CO可壓縮性較小，溶解能力增加有限，同時壓力過高會導致CO流體的擴散性降低，造成CO流體與白及粉末在萃取釜中接觸速率下降，進而降低其萃取率。因此從提取率和能耗綜合分析在其他條件不變的情況下，萃取壓力取25 MPa時為最佳。

白及粉碎粒度對二氧化碳超臨界提取白及揮發(fā)油提取率的影響：固定二氧化碳超臨界提取壓力為25 MPa，提取溫度為50℃的提取條件時，考察白及粉碎粒度對白及揮發(fā)油提取的影響。當白及粉碎粒度分別為5、10、20、40、60、80目的條件下，白及揮發(fā)油的得率分別為8.2、9.3、10.3、12.7、12.9、13.1 mg·g。由試驗結(jié)果可知白及揮發(fā)油的得率與白及粉碎目數(shù)成正比關系，當白及粉碎超過60目時因白及多糖含量較高粉碎難度較大，部分動能轉(zhuǎn)化為熱能不易粉碎，故選擇最佳粉碎粒度為40目。

二氧化碳超臨界提取溫度對白及揮發(fā)油提取率的影響：設定二氧化碳超臨界提取壓力為25 MPa，白及粉碎粒度40目的提取條件下，研究萃取釜的提取溫度對白及揮發(fā)油提取的影響。當萃取釜溫度分別在30、35、40、45、50、55、60℃時，白及揮發(fā)油的得率分別為4.9、6.3、9.2、11.1、12.6、12.8、12.9 mg·g。由試驗結(jié)果可知白及揮發(fā)油的得率隨溫度的升高而增高，當溫度在50℃時提取率達到最大值，超過50℃后提取率升高不明顯，綜合儀器的能耗和操作的安全性初步確定最佳提取溫度為50℃。

2.1.2 模型建立與結(jié)果分析

利用Design- Expert 8.0.6 軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及結(jié)果分析得到了白及揮發(fā)油提取率()對自變量二氧化碳超臨界提取壓力()、提取溫度()、白及原材料粉碎粒度()的多元二次回歸方程為:提取率()=1.23+0.064+0.051+0.11?0.053?0.005?0.015?0.07A?0.16B?0.077C。

表2 二氧化碳超臨界提取試驗方法與試驗結(jié)果

從表3方差分析結(jié)果可知，試驗對于白及揮發(fā)油提取率模型值<0.000 1，差異極顯著，表明該條件下2次方程模擬效果比較顯著，回歸效果良好；失擬項結(jié)果值為0.186 2，滿足>0.05差異顯著，表明失擬不顯著，試驗誤差較小，模型對試驗擬合程度良好。

根據(jù)方差分析結(jié)果，值越大因素對模型影響越大為原則，各單因素對提取率的影響依次為藥材粉碎粒度>提取壓力>提取溫度。同時由圖1可知，各項因素交互效果良好，各曲面圖有一定的彎曲程度。利用Design-Expert 8.0.6對回歸方程的極值進行預測分析，預測得到了模型極值點，即最優(yōu)參數(shù)分別為粉碎粒度為53.78目、提取壓力為27.32 MPa、提取溫度為50.26℃時，響應值Y 值達到最大，在此條件下?lián)]發(fā)油提取率預測值為1.284%。為驗證模型的準確性和可靠性，根據(jù)模型優(yōu)化得到的最優(yōu)條件和儀器本身限制設置粉碎粒度50目、提取壓力27 MPa、提取溫度50℃時對模型模擬得到的最優(yōu)工藝進行驗證，實驗結(jié)果表明提取率預測值與實際測定值較為接近，分別為1.27%、1.28%、1.27%。

表3 Box-Behnken 響應面試驗方差分析

2.2 揮發(fā)油主成分分析

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術對最佳工藝提取的白及揮發(fā)油進行分析，從白及揮發(fā)油樣品中共檢測出146種物質(zhì)，通過NIST14.L 標準譜庫對白及揮發(fā)性化學成分進行相似度匹配，鑒定出匹配度高于85的72種可能物質(zhì)，提取的特征離子色譜圖見圖2，具體化合物明細詳見表4。檢測出的物質(zhì)相對含量占總物質(zhì)的92%。白及揮發(fā)油的主要化學成分有酸、酯、醇、醛、多環(huán)烴以及少量的含氮化合物。其中，有機酸類物質(zhì)17種，占揮發(fā)油相對含量的34.6%；酯類物質(zhì)8種，占相對含量的20.1%；醇酚類物質(zhì)11種，占相對含量的14.6%；烷烴類物質(zhì)11種，占相對含量的13.8%；醛酮類物質(zhì)11種，占相對含量的13.4%；其他類物質(zhì)12種，占相對含量的3.9%。

圖1 各因素間的交互作用

圖2　GC-MS 特征離子色譜圖

表4 白及揮發(fā)油的組成及相對含量

續(xù)表4

4 結(jié)論與討論

白及是一種傳統(tǒng)常見中藥，其不僅用藥歷史悠久，而且藥用價值高?，F(xiàn)代研究表明白及含有大量多糖類、多酚類、菲類、芪類等成分，具有清熱利濕、消腫生肌、收斂止血的作用。前期國內(nèi)外研究多集中于白及多糖和其藥理活性，隨著化學成分研究的不斷深入，藥理活性研究也逐步從多糖轉(zhuǎn)向多酚類、菲類、芪類成分的研究。白及具有一定的芳香氣味，關于白及揮發(fā)油的提取工藝和成分分析未見報道，為順應研究發(fā)展的需求，本研究對白及揮發(fā)油提取工藝進行摸索和研究，提取得到白及揮發(fā)油，并對白及揮發(fā)油成分進行分析，補充白及揮發(fā)油提取和化學成分研究方面的缺陷和不足。

二氧化碳超臨界提取的白及揮發(fā)油與其他植物揮發(fā)油比較發(fā)現(xiàn)，白及揮發(fā)油顏色為鮮紅色，對白及揮發(fā)油的化學成分分析發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油中含有一定的醌類化合物，而醌類化合物具有一定的顏色，在食品和工業(yè)中多作染色劑使用，故白及揮發(fā)油成色物質(zhì)可能為其中所含的醌類化合物。

白及揮發(fā)油中含有一定的蒽、菲、芘、芴類成分，其相對含量約占鑒定成分含量的5.05%，該類成分具有一定的致癌性，上述四類成分均在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考的3類致癌物清單中。如何健康合理的利用中藥成為目前中藥發(fā)展亟待解決的問題，隨著科技手段的發(fā)展和進步，中藥去除有害成分保留有效成分變?yōu)榭赡?，伴隨白及揮發(fā)油的生物活性進一步明確和驗證，白及作為藥材使用時其揮發(fā)油是否保留的問題將得到解決。

本研究首次采用二氧化碳超臨界提取白及中的揮發(fā)油，利用響應曲面法對揮發(fā)油的提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝；對最優(yōu)工藝提取的白及揮發(fā)油進行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，得到白及揮發(fā)油的主要化學成分。為白及化學成分的研究和白及揮發(fā)油的應用奠定基礎。

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Optimization ofVolatile Oil Extraction Process by Response Surface Method

JIN Zhiwei, YANG Weixiong, YIN Jianhua, WANG Junmin, YAN Yi

(1.; 2)

Based on single factor testing, the response surface method was used to study the influence of the crushing particle size, pressure and temperature on the extraction of volatile oil fromin order to identify the best process for extraction of such oil. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was then used to analyze the chemical composition of the oil extracted. The best extraction conditions for maximising the extraction rate proved to be: particle size 50 mesh, extraction pressure of 27 MPa and extraction temperature of 50℃. In the volatile oil extracted, 72 compounds were identified by a NIST14 mass spectral library search, withthe content of each component determined by the peak area unification method. Together these identified compounds accounted for 92% of the total volume of the volatile oil.

; volatile oil; COsupercritical extraction; extraction process conditions; response surface method

S567

A

10.13987/j.cnki.askj.2021.03.009

昆明市科技計劃項目“昆明市森林生態(tài)保護及附屬產(chǎn)業(yè)院士工作站”(2019-1-H-24317)

金智偉(1982— )，男，本科，工程師，主要從事森林培育研究，E-mail:232389647@qq.com

嚴毅(1986— )，女，碩士研究生，高級工程師，主要從事森林培育研究，E-mail:yanyiok@yeah.net