李順濤，馬宇航，梅麗，丁曉穎，彭永德

1.安徽省阜陽市第九人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，阜陽 236000；2.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

骨質疏松(OP)是一種多病因的疾病，發(fā)病機理復雜，目前尚無特效治療手段。OP的防治藥物主要有兩大類，即骨轉換抑制劑和骨形成刺激劑。骨轉換抑制劑只能減少骨質重塑部位，不能很好地改善骨質量。然而，臨床上可供選擇的骨形成刺激劑的藥物較少，效果有限，因而開發(fā)促進骨形成的新穎、高效、小分子抗OP活性肽是國內(nèi)外關注的重要研究方向。骨代謝局部調(diào)節(jié)因子與其受體、結合蛋白和蛋白酶構成的網(wǎng)絡是骨重建部位調(diào)節(jié)系統(tǒng)的核心[1-4]?；铙w骨通過成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收持續(xù)不斷地進行骨重建。在生理狀況下，骨髓的成骨和破骨潛能限制在較低的水平。而在骨髓損傷或去除骨髓等病理狀態(tài)下，伴隨骨髓再生，局部及全身性成骨反應增強。因而推測，再生的骨髓可能釋放了某種促成骨因子入血循環(huán)[5-6]。

Bab等[7]從大鼠脛骨再生骨髓中分離、純化、鑒定了一種促成骨細胞增殖的生長因子，中文譯名為成骨生長肽(OGP)。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，OGP羧基端5肽OGP(10-14)(H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)具有和全長OGP相同的生物活性，視為OGP的生理活性形式，OGP(10-14)能夠呈時間-劑量依賴模式，誘導絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性，觸發(fā)胞內(nèi)級聯(lián)瀑布式信號轉導網(wǎng)絡，MAPK家族在調(diào)節(jié)膜受體和基因表達譜變化之間的關系中發(fā)揮著關鍵作用，參與調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和間充質干細胞向成骨細胞系的分化[10]。通過受體后信號轉導，MAPK磷酸化后被激活，轉運至胞核，作用于特定轉錄因子，尚可調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子(IGFs)的表達。IGFs是一種多功能細胞調(diào)控因子，與成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC)功能的發(fā)揮密切相關。核心結合因子(cbfal)作為成骨細胞分化的特異性轉錄因子，調(diào)控OB發(fā)育過程中多個基因的表達，對成骨細胞分化、骨的發(fā)育和形成具有關鍵作用[11-13]。cbfa1可調(diào)節(jié)破骨細胞分化因子(ODF)mRNA的表達，與cbfa1-/-小鼠顱骨細胞共培養(yǎng)的破骨細胞數(shù)量和骨吸收能力均較cbfa1+/+，cbfa1+/-組顯著降低，提示cbfa1在調(diào)節(jié)成骨細胞分化的同時也參與了破骨細胞形成和分化的調(diào)節(jié)。本組既往的動物研究[14-17]發(fā)現(xiàn)，OGP及其羧基端5肽OGP(10-14)通過調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的增殖與分化，參與調(diào)節(jié)骨重建兩種重要細胞功能偶聯(lián)平衡。

本研究采用四唑鹽(MTT)比色法、堿性磷酸酶(ALP)活性測定和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術觀察了OGP(10-14)(G36G)及其類似物G48A[OGP(10-14)分子內(nèi)位點進行非天然化結構改造，加強對抗酶降解的能力]對OB增殖、分化和IGF-1、cbfa1轉錄水平的影響，以了解可能參與OGP信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的其他局部因子的表達情況，為進一步采用基因沉默或特異蛋白抑制劑等技術的研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由上海斯萊克實驗動物中心提供。Ⅰ型膠原酶、噻唑藍、胰蛋白酶、α-MEM為聯(lián)星實業(yè)有限公司產(chǎn)品。PTH(1-34)為Sigma公司產(chǎn)品。牛血清白蛋白(BSA)為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。DNTPs，Rnasin，Taq DNA聚合酶，M-MLV逆轉錄酶為Promega公司產(chǎn)品。Trizol試劑，Oligo(dT)12-18引物為Invitrogen公司產(chǎn)品。OGP(10-14)(G36G)，G48A由中國醫(yī)學科學院藥物研究所王德心教授惠贈。5810R低溫高速離心機為德國Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH公司產(chǎn)品。PCR擴增儀PE9600為美國PERKIN ELMER公司產(chǎn)品。DH2000生命科學圖像分析系統(tǒng)由中國計量科學研究院京華電計量新技術公司提供。Windows 1D Main凝膠圖像分析系統(tǒng)由美國AAB公司提供。

1.2 方法

1.2.1 OB的培養(yǎng)和傳代 取24 h內(nèi)新生SD大鼠，無菌取頭蓋骨，置于α-MEM培養(yǎng)基中，剪成1 mm2大小的碎片。加入0.25%胰蛋白酶，電磁攪拌消化。將骨碎片移入0.1%Ⅰ型膠原酶溶液中，37 ℃攪拌消化3次，每次30 min。100目篩網(wǎng)過濾，將含細胞的消化液離心10 min，棄上清。用α-MEM培養(yǎng)液反復吹打細胞團塊，細胞按2×104/mL密度接種于培養(yǎng)板或按2×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中。待原代OB覆蓋培養(yǎng)瓶底80%以上的面積時，加入消化液(0.25%胰蛋白酶與0.2%乙二胺四乙酸混合液)，輕搖培養(yǎng)瓶，置瓶于培養(yǎng)箱中消化2～5 min，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮，胞體呈原球形，終止消化。培養(yǎng)傳代，取3代OB進行試驗。

1.2.2 OB的增殖、ALP測定 3代OB以4×103個/孔的密度接種于96孔板，OB同步化培養(yǎng)方案同前。將OB分為10組，更換含有不同處理因素的無血清培養(yǎng)基(含轉鐵蛋白100 μg/mL，輔胺100 μM，亞硝酸鈉30 nM，胰島素5 μg/mL，BSA 10 mg/mL)：(1)G36G：4組培養(yǎng)液中G36G濃度分別為10-7M，10-9M，10-11M，10-13M；(2)G48A：4組培養(yǎng)液中G48A濃度分別為10-7M，10-9M，10-11M，10-13M；(3)甲狀旁腺激素(PTH)間刺組：后6 h培養(yǎng)液中PTH濃度為10-8M；(4)CON組：培養(yǎng)液中含1%的BSA。MTT比色法：每6孔細胞作為一組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入15 μL MTT(5 μg/mL)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。小心吸棄上清，加入50 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，使結晶物充分溶解。以無細胞的空白孔調(diào)零，在酶標儀上(波長570 nm)讀取各孔吸光度。ALP測定：每6孔細胞作為一組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，半自動生化分析儀檢測細胞上清液ALP的水平，以紫外法測定培養(yǎng)液OD280值作為蛋白含量校正系數(shù)。

1.2.3 OB超微結構觀察 3代OB以2×104個/mL的密度接種于250 mL培養(yǎng)瓶，OB同步化培養(yǎng)方案同前。將OB分為4瓶，更換含有不同處理因素的無血清培養(yǎng)基(含轉鐵蛋白100 μg/mL，輔胺100 μM，亞硝酸鈉30 nM，胰島素5 μg/mL，BSA 10 mg/mL)：(1)G36G組：培養(yǎng)液中G36G濃度為10-11M；(2)G48A組：培養(yǎng)液中G48A濃度為10-13M；(3)PTH組：后6 h培養(yǎng)液中PTH濃度為10-8M；(4)CON組：培養(yǎng)液中含1%的BSA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)瓶中的細胞上清液，磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)沖洗1次，加入0.125%胰蛋白酶37 ℃消化3 min，1 000 r/min離心10 min。在沉淀的細胞團塊中加入2.5%的戊二醛固定60 min。PBS沖洗后，細胞沉淀團塊經(jīng)1%鋨酸固定60 min。PBS漂洗3次。按下列順序梯度脫水：50%丙酮1次、70%丙酮1次，90%丙酮2次，100%丙酮3次。EPON812樹脂包埋，LKB-V超薄切片機切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，Philips EM400-ST型透射電鏡觀察，攝片。

1.2.4 OB總RNA的提取、逆轉錄和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增 3代OB以2×104/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，在含10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)46 h后，更換無血清培養(yǎng)基(含轉鐵蛋白100 μg/mL，輔胺100 μM，亞硝酸鈉30 nM，胰島素5 μg/mL，BSA 10 mg/mL)繼續(xù)孵育24 h使細胞同步化在G0期。將OB分為4組：(1)G36G組：培養(yǎng)液中G36G濃度為10-11M；(2)G48A組：培養(yǎng)液中G48A濃度分別為10-13M；(3)PTH組：培養(yǎng)中PTH濃度為10-8M；(4)CON組：培養(yǎng)液中含1%BSA。每6孔細胞作為一組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取RNA，將RNA溶解于0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。取部分RNA溶液，測定A260，推算其濃度(A260值×40 μg/mL×稀釋倍數(shù))；測定A260/A280比值,評價總RNA純度；甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下觀察凝膠28S、18S、5S條帶的亮度及位置，判斷RNA的完整性。模板變性RNA，Oligo(dT)18，DEPC水70 ℃ 5 min，即刻冰??；逆轉錄反應Rnasin，dNTP，M-MLV 42 ℃ 60 min；滅活逆轉錄酶活性70 ℃ 10 min。-20 ℃保存cDNA。

1.2.5 RT-PCR檢測OB cbfa1和IGF-1 mRNA表達水平 (1)引物設計：Gene-Runner 3.04軟件設計，北京奧科生物技術公司合成。IGF-1引物序列Sense 5’-TTACTTCAACAA GCCCACAG-3’，Antisense 5’-CCTCAAGCAGCAAAGGAT C- 3’，PCR產(chǎn)物長度310 bp。Cbfa1引物序列Sense 5’-CAAGGTTGTAGCCCTCGG AG-3’，Antisense 5’-AATGCGCCCTAAATCACTG-3’，PCR產(chǎn)物長度337 bp。β-actin引物序列Sense 5’-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3’，Antisense5’-CTTAGGAGT TGGGGG TGGCT-3’，PCR產(chǎn)物長度742 bp。(2)PCR分別擴增OB的cbfa1和IGF-1目的片段：Taq酶，CDNA，dNTP，引物等試劑在Eppendorf管中短暫混勻，PCR反應條件如下：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 45 s，72 ℃延伸5 min，取5 μL PCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，凝膠圖像采集。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。正態(tài)分布變量，滿足齊性行方差分析，組間比較采用LSD法；方差不齊時，行變量變換或用Dunnett’s T3法。非正態(tài)分布變量采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞的培養(yǎng)與鑒定 倒置顯微鏡下，剛接種的OB呈懸浮的亮球，1 d后多數(shù)呈梭形、多角形貼壁，培養(yǎng)3 d細胞增殖旺盛，培養(yǎng)5 d細胞半?yún)R合，培養(yǎng)7 d細胞匯合呈鋪路石狀，培養(yǎng)9 d細胞重疊生長，培養(yǎng)14～16 d細胞結節(jié)形成，基質堆積，培養(yǎng)25 d礦鹽沉積，礦化結節(jié)形成，ALP染色可見OB胞質內(nèi)塊狀灰黑色沉淀。透射電鏡下，OB具有典型的蛋白合成結構，含豐富的線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)及大量分泌小泡，高爾基器也較發(fā)達。G36G組、G48A組、PTH組細胞形狀豐滿，呈多邊形，核膜清晰，部分粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張，高爾基器發(fā)育良好，胞漿內(nèi)分泌顆粒增多。CON組無血清連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天后，多數(shù)細胞死亡退變，胞體扁平，胞內(nèi)部分細胞器喪失。

2.2 不同處理因素對大鼠OB增殖及ALP活性的影響 MTT比色法測定，G36G組在10-7～10-15M濃度范圍內(nèi)，OB細胞數(shù)隨濃度而波動，10-11M為作用最強濃度；G48A組在10-7～10-15M濃度范圍內(nèi)，OB細胞數(shù)呈雙峰變化，促進OB形成的最強濃度為10-13M；G36G組與G48A組達最大效應時的OB數(shù)目均高于PTH，CON組。G36G組的峰值效應與PTH組相似，高于G48A組的峰值效應；CON組OB增殖能力低于PTH組，G36G，G48A不同濃度組(P<0.05)。ALP活性測定：G36G與G48A不同濃度組，PTH組ALP活性均顯著高于CON組(P<0.05)。G48A組在10-9～10-15M的濃度，促進OB ALP活性的效應漸增，其中在10-15M作用最強。G36G組在10-9～10-15M的濃度，促進OB ALP活性的效應呈鐘形曲線，峰值濃度在10-13M(P<0.05)。

2.3 不同處理因素對大鼠OB cbfa1 mRNA、IGF-1 mRNA表達的影響 RNA提取純度和完整性檢測，各組細胞RNA提取OD260/OD280值均介于1.7～2.0之間，說明總RNA純度較高，基本無蛋白質的污染。各組細胞總RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結果示，28S與18S電泳條帶的吸光度比值為2.0左右，5S條帶較弱，RNA的完整性較好，基本無降解(表1)。G36G、G48A、PTH組cbfa1 mRNA與IGF-1 mRNA均顯著高于CON組(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，見表2。

表1 不同處理因素組OB總RNA提取純度一覽表

表2 RT-PCR檢測不同處理因素對OB的cbfa1、IGF-1 mRNA表達水平的影響

3 討論

骨質疏松的干預措施包括兩大策略，抑制骨吸收與促進骨形成[18-19]。抑制骨吸收只能維持骨量，而促進骨形成可有效地提高和改善骨質量。OGP是近年在大鼠脛骨再生骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種致有絲分裂的多肽類生長因子[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓捐獻者中，可觀察到骨髓抽吸后，骨髓捐獻者的血清骨形成生化標志物血清骨鈣素(BGP)和ALP水平的上升，以上現(xiàn)象提示再生的骨髓可能產(chǎn)生了某種影響成骨的生長因子。OGP 羧基端5肽[OGP(10-14)]是OGP的生理活性形式，OGP 和OGP(10-14)在骨與骨髓相互關系中的作用已引起廣泛關注[22-23]。OGP可以促進成骨細胞系MC3T3 E1、成纖維細胞系NIH3T3和骨髓基質細胞的增殖，調(diào)節(jié)ALP活性，促進基質礦化[24-25]。不同的細胞類型對OGP劑量依賴反應的濃度區(qū)間不同，可能與不同的OGP-OGP受體相互作用機制的差異有關[26]。OGP對成骨細胞系MC3T3 E1細胞達到最佳增殖效應的濃度(0.01～1 pM)較成纖維細胞系NIH3T3(1～100 pM)至少低兩個數(shù)量級，說明成骨細胞系對OGP更為敏感。

研究報道，OGP刺激大鼠顱蓋骨成骨細胞的增殖(峰值效應時OGP濃度為10-11M)，促進其骨鈣素的表達，胞內(nèi)及培養(yǎng)液堿性磷酸酶活性上升。已往的體外試驗研究表明，PTH能引起OB IGF-1 mRNA的變化，體內(nèi)試驗也已證實PTH間歇性注射能促進骨形成，由此設想，骨形成促進劑OGP是否在調(diào)節(jié)OB的增殖與分化中，具有與PTH相似的機制，也有IGF-1信號的參與[27-30]。

OSF2/CBFA1是cbfa1基因編碼的轉錄激活因子，在骨形成中發(fā)揮重要的角色，稱為成骨細胞特異性轉錄因子/核心結合因子a，屬于RUNT結構域家族[31-32]。OSF2/CBFA1一級結構存在三個轉錄激活區(qū)、一個抑制區(qū)、一個短的核定位信號，和一個128氨基酸的高度保守區(qū)即Runt結構域，是與共同的DNA作用元件5’-PuACCPuCA-3’結合的區(qū)域。DNA這一固有的序列存在于細胞不同分化階段多種表達基因的控制區(qū)中，如GM-CSF、IL-3、TGFβ1等細胞因子及其受體的基因，Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、骨鈣素、骨涎蛋白、骨保護素等成骨細胞特異表達基因的啟動子中。有研究發(fā)現(xiàn)，OSF2/CBFA1在成年鼠骨組織和成骨細胞有表達，可作為年輕成骨細胞的標志，且表達高峰與鼠胚胎骨骼初期的鈣化期相臨近。鼠胚骨骼間充質細胞有OSF2/CBFA1的表達，具有成骨細胞系和成軟骨細胞系分化的潛力，提示OSF2/CBFA1調(diào)控OB發(fā)育過程中多個基因的表達。未分化MC3T3E1瞬時轉染cbfa1可觀察到Ⅰ型膠原、骨鈣素表達升高。有研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞在BMP2和BMP7的作用下，在表達成骨細胞特異性基因之前，首先表達OSF2/CBFA1，提示OSF2/CBFA1在BMP誘導成骨細胞分化的級聯(lián)效應中起到了信號傳遞的作用。

在本研究中觀察了OGP(10-14)及其類似物G48A和PTH對OB 增殖、分化和IGF-1，cbfa1 mRNA表達的影響。參考不同濃度G36G與G48A對OB增殖功能和分化的促進作用，對每種處理因素選取一個濃度觀察對OB IGF-1，cbfa1 mRNA表達的影響，結果表明G36G，G48A，PTH間歇刺激組cbfa1，IGF-1 mRNA水平均顯著高于CON組，提示cbfa1與IGF-1這兩種信息因子表達水平的上調(diào)可能與OGP(10-14)及其類似物對OB的生物學作用有關[33-34]。

在OB基因表達水平上，OGP(10-14)及其類似物G48A可在轉錄水平促進OB IGF-1、cbfa1 mRNA的表達，應用反義核酸技術，通過堿基互補配對與成骨細胞內(nèi)Cbfa1 mRNA的結合，從而在轉錄水平特異性抑制Cbfa1的表達，或應用特異IGF-1蛋白抑制劑，阻斷兩者介導的信號傳遞以進一步研究cbfa1與IGF-1在OGP 信號轉導中所起的作用，有助于了解OGP(10-14)生物活性的調(diào)控因素。近年體內(nèi)外研究提示，OGP能夠促進骨形成，加速骨折愈合，且副作用較小[35-37]。如果通過胃腸外途徑給予OGP，合理地調(diào)控其成骨反應，使之得以被反復地觸發(fā)，進而改善骨質量，降低遠期骨折率，有望成為極具吸引力的抗骨質疏松新藥。深入研究OGP(10-14)在骨代謝中的作用機理，可能為將來骨質疏松的防治提供新的研究方向和治療策略。