侯海濤，尚翠霞，鄧景元，崔延超，趙昭，陸鵬，沈劍南，馬姣，姚力

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,a 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，b 胸外科,西安 710061

盡管近十年來(lái)乳腺癌的治療取得了巨大進(jìn)步，但仍有許多晚期乳腺癌患者遭受著癌痛帶來(lái)的身體、精神-社會(huì)相關(guān)的痛苦[1]。因此，鎮(zhèn)痛治療已成為乳腺癌治療的一個(gè)重要組成部分[2]。芬太尼為人工合成的μ受體激動(dòng)阿片類(lèi)強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥物，廣泛應(yīng)用于癌癥圍手術(shù)期止痛或緩解晚期癌痛或放化療引起的疼痛[3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明芬太尼對(duì)癌癥患者的長(zhǎng)期預(yù)后有潛在的影響。然而，關(guān)于阿片類(lèi)藥物對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的影響存在爭(zhēng)議[4]。這可能是因?yàn)樵诓煌橄侔﹣喰椭?，芬太尼能選擇性地促進(jìn)或抑制各異的基因/蛋白表達(dá)，從而影響乳腺癌進(jìn)展。因此，針對(duì)不同機(jī)制進(jìn)行更有針對(duì)性的研究，對(duì)于闡明芬太尼在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用十分必要，從而為乳腺癌的預(yù)防和治療提供相關(guān)證據(jù)。

Yes-相關(guān)蛋白(YAP)作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，其過(guò)表達(dá)或激活多被認(rèn)為是促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移的致癌因子[5]，但也有研究表明YAP1可以通過(guò)促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)免疫而發(fā)揮抑瘤作用[6]。YAP的表達(dá)與乳腺癌分子亞型、腫瘤細(xì)胞成分及所處微環(huán)境相關(guān)。所以針對(duì)Hippo信號(hào)通路相關(guān)的靶向藥物治療現(xiàn)已成為乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)[7]。YAP的激活主要通過(guò)Hippo信號(hào)通路、機(jī)械應(yīng)力、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號(hào)通路、蛋白質(zhì)相互作用以及轉(zhuǎn)錄后修飾等途徑調(diào)控[8]。最重要的是，最近在乳腺細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了YAP信號(hào)通路的胞外調(diào)節(jié)因子，如溶血磷脂酸(LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、雌激素和兒茶酚胺。這些細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子作為配體，通過(guò)結(jié)合不同的GPCR，激活或者抑制YAP/TAZ表達(dá)[9-11]。有趣的是芬太尼激活的μ受體也是一種GPCR，其能否調(diào)控YAP信號(hào)通路從而影響乳腺癌的生長(zhǎng)？

本研究將通過(guò)研究芬太尼在乳腺癌細(xì)胞系中對(duì)YAP的調(diào)控作用及作用機(jī)制，討論不同YAP表達(dá)下芬太尼對(duì)乳腺癌發(fā)展的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)基成分為：RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS,Thermo Fisher，中國(guó)，上海)、0.3 g/L谷氨酰胺和100 IU /mL青霉素和100 μg/L鏈霉素的 (Invitrogen,MA,USA)。培養(yǎng)箱條件為37 °C,一氧化碳(CO)濃度為5%。對(duì)照shRNA及YAP下調(diào)shRNA由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司構(gòu)建，轉(zhuǎn)染過(guò)程按照廠(chǎng)家指導(dǎo)進(jìn)行。使用芬太尼(2.0 μg/L)干預(yù)細(xì)胞時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去血清培養(yǎng)16 h。小分子MOR抑制劑cyprodime hydrochloride及Gi蛋白抑制劑Pertussis toxin均購(gòu)于R&D公司，對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理濃度及時(shí)間分別為10 nM作用2 h和100 μg/L作用16 h。

1.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT) 將MCF-7細(xì)胞接種于密度為2×103/孔的96孔板中24 h，然后用芬太尼處理或作為對(duì)照。孵育72 h后，每孔取20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，將甲瓚沉淀溶解于DMSO中。使用微滴度平板閱讀器測(cè)定在570 nm和630 nm(背景)吸光度。細(xì)胞活力表示為活細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照的百分比。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍。IC50由每個(gè)細(xì)胞系的劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)產(chǎn)生。

1.3 細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn) Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)試劑盒(Roshe Applied Science,Germany)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，用shRNA處理6 h。用accutase酶消化細(xì)胞，用冰冷PBS洗滌2次，然后在HEPES緩沖液中重懸細(xì)胞，并同時(shí)加入標(biāo)記有annexin v-熒光素和PI的抗體。避光孵育后，流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)分析細(xì)胞凋亡率。

1.4 Western Blot 用RIPA buffer (Beyotime,China)提取GBM細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(中國(guó)Beyotime公司)測(cè)定蛋白濃度。然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)到PVDF膜(Millipore,USA)上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜。然后將一抗phospho-YAP、YAP、pMST1/2、MST1/2、pLATS1、LATS1、Survivin和Bcl2(均購(gòu)于Santa Cruz)在4 ℃孵育過(guò)夜；二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h后TBST洗3次后顯影。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和Quantitative-one軟件檢測(cè)分析蛋白表達(dá)水平。

1.5 體外成瘤實(shí)驗(yàn) 雌性裸鼠(Balb/c-nu/nu)來(lái)自西安交通大學(xué)動(dòng)物中心。小鼠(4～6周)飼養(yǎng)于無(wú)菌級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。40只小鼠成長(zhǎng)至8周后分為2組，每組20只，分別接種YAP正常表達(dá)及YAP敲除MCF-7細(xì)胞： 5×106個(gè)細(xì)胞加入生長(zhǎng)因子降低的Matrigel (Becton、Dickinson和Company)以1∶1(v∶v)比例懸浮，皮下注射至右側(cè)。植入7 d后，將上述兩組小鼠再隨機(jī)分為0.9%氯化鈉注射溶液治療組和芬太尼治療組(每24 h皮下注射0.02 mg/kg) (n=10)，第40天頸椎脫位處死。剝除植入腫瘤并測(cè)量。腫瘤體積按公式計(jì)算：體積=長(zhǎng)×寬2/2。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)西安交通大學(xué)倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.6 免疫組織化學(xué) 切除荷瘤小鼠皮下腫瘤，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，在二甲苯中脫蠟，在濃度梯度酒精中水化。PBS洗滌載玻片，3% H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用山羊血清在室溫下孵育30 min，阻斷非特異性結(jié)合，然后在4 ℃濕盒中孵育一抗過(guò)夜。用PBS洗滌后，在室溫下孵育生物素化二抗15 min。然后鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育，用DAB試劑盒顯影。顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

注：**P<0.01,***P<0.001；YAP為Yes-相關(guān)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)YAP可促進(jìn)芬太尼誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡 首先，本組研究了芬太尼在乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖中的作用。如圖1A所示，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)論在YAP正常表達(dá)組還是YAP低表達(dá)組，芬太尼干預(yù)后細(xì)胞的OD值均顯著降低(P<0.01,P<0.001)，提示芬太尼可以抑制MCF-7細(xì)胞的增殖能力。計(jì)算抑制率后本組發(fā)現(xiàn)，芬太尼對(duì)YAP shRNA組細(xì)胞具有更高的抑制率(圖1B，P<0.001)。細(xì)胞增殖能力的降低主要是由于細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了芬太尼對(duì)正常YAP表達(dá)及YAP低表達(dá)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用，如圖1C所示，流式細(xì)胞結(jié)果證實(shí)，芬太尼可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡，當(dāng)YAP表達(dá)受抑制后，這種促進(jìn)凋亡的作用顯著增強(qiáng)(表1，圖1C，P<0.01)。

表1 流式細(xì)胞檢測(cè)芬太尼對(duì)不同YAP表達(dá)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 芬太尼促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中YAP去磷酸化 YAP蛋白的活化主要表現(xiàn)為其絲氨酸127位(Serine 127)殘基的去磷酸化(dephosphorylation)。因此，本研究檢測(cè)了芬太尼是否影響MCF-7細(xì)胞中YAP的表達(dá)或磷酸化。如圖2A所示，芬太尼顯著抑制了磷酸化YAP的表達(dá)(t=4.769，P=0.041 3)。既往研究顯示，非磷酸化的YAP只有進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)才能作為共轉(zhuǎn)錄激活因子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞核中YAP的表達(dá)，結(jié)果顯示芬太尼顯著提高乳腺癌細(xì)胞核中YAP蛋白的表達(dá)(圖2B，t=48.66，P=0.000 4)。

注：YAP為Yes-相關(guān)蛋白。

2.3 MOR-Gi通路介導(dǎo)芬太尼誘導(dǎo)YAP去磷酸化 由于芬太尼是μ阿片受體(MOR)的強(qiáng)激動(dòng)劑，本研究驗(yàn)證了MOR是否參與芬太尼誘導(dǎo)的YAP去磷酸化。采用選擇性MOR抑制劑cyprodime hydrochloride對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。cyprodime hydrochloride可以顯著消除芬太尼誘導(dǎo)的YAP去磷酸化 (圖3A，表2)。此外，Gi蛋白抑制劑Pertussis toxin(PTX)也可以抑制芬太尼誘導(dǎo)的YAP去磷酸化(圖3B，表3)。

注：YAP為Yes-相關(guān)蛋白；MOR為μ阿片受體。

表2 MOR受抑制后芬太尼對(duì)磷酸化YAP的表達(dá)影響減少

表3 Gi蛋白受抑制后芬太尼對(duì)磷酸化YAP的表達(dá)影響減少

2.4 芬太尼誘導(dǎo)YAP下游因子Survivin及BCL2表達(dá) 活化的YAP可以促進(jìn)抗凋亡基因 (如Survivin,BCL2) 轉(zhuǎn)錄，抗凋亡基因高表達(dá)與成瘤性相關(guān)[12]，所以我們進(jìn)一步測(cè)試了芬太尼與Survivin和Bcl2表達(dá)的關(guān)系。如圖4所示，芬太尼顯著增加了MCF-7細(xì)胞中Bcl2 和survivin的蛋白表達(dá)(圖4)。同時(shí)，當(dāng)在MCF-7細(xì)胞中敲除YAP后，消除了芬太尼誘導(dǎo)的Bcl2和survivin高表達(dá)(圖4，表4，表5)。

表4 YAP受抑制后芬太尼對(duì)其下游蛋白survivin的表達(dá)影響減少

表5 YAP受抑制后芬太尼對(duì)其下游蛋白Bcl2的表達(dá)影響減少

2.5 體內(nèi)研究下調(diào)YAP對(duì)芬太尼抑制乳腺癌生長(zhǎng)的影響 為了研究YAP和芬太尼對(duì)腫瘤生長(zhǎng)在體內(nèi)的作用，我們使用未敲除YAP的MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞，YAP敲除MCF-7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，在BALB/cnu/nu裸小鼠體內(nèi)皮下成瘤。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)試驗(yàn)，驗(yàn)證腫瘤中YAP的表達(dá)(圖5A)。

注：YAP為Yes-相關(guān)蛋白。

注：YAP為Yes-相關(guān)蛋白。

與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，圖5B所示，在YAP敲除組中，芬太尼可顯著降低的腫瘤體積[(405±123)mm3比(251±96)mm3,t=6.622,P=0.022]，而在對(duì)照組細(xì)胞中，芬太尼對(duì)乳腺腫瘤的生長(zhǎng)影響較小[(589±102)mm3比(501±81)mm3,t=0.911,P=0.458]。

3 討論

癌癥鎮(zhèn)痛為癌癥治療重要組成部分，而研究表明，麻醉及圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛干預(yù)可能影響乳腺癌細(xì)胞行為并與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)[2]。

芬太尼家族為鴉片類(lèi)受體合成鎮(zhèn)痛劑，現(xiàn)已越來(lái)越被廣泛應(yīng)用于晚期乳腺癌患者的鎮(zhèn)痛[13]。但芬太尼對(duì)乳腺癌的轉(zhuǎn)移及侵襲作用仍存在爭(zhēng)議，比如有研究發(fā)現(xiàn)芬太尼可以通過(guò)Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的α1.6-巖藻糖基化，促進(jìn)MCF-7和MDA-MB-231干性及EMT，從而促進(jìn)腫瘤形成[14-15]。而趙海燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)芬太尼可以抑制MCF-7的轉(zhuǎn)移及侵襲，同時(shí)有研究認(rèn)為芬太尼可以抑制NK細(xì)胞等免疫功能，影響腫瘤周?chē)庖呶h(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[17]。也有研究表明鴉片類(lèi)藥物使用與乳腺癌復(fù)發(fā)并無(wú)臨床相關(guān)性[18]，因此闡明芬太尼是否促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其機(jī)制，對(duì)臨床乳腺癌患者能否應(yīng)用芬太尼止痛具有十分重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)痛濃度的芬太尼(2.0 μg/L)在體外能促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，從而有效抑制乳腺細(xì)胞增殖。在探討其機(jī)制時(shí)，本組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MCF-7細(xì)胞中YAP的表達(dá)抑制后，芬太尼顯示出了更強(qiáng)的抑制作用。YAP是一種共轉(zhuǎn)錄激活因子，其信號(hào)活化可以通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞骨架、促進(jìn)細(xì)胞黏附、血管生成、促進(jìn)EMT，提高乳腺癌干細(xì)胞的干性等各個(gè)方面促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[19]。因此，本研究這一發(fā)現(xiàn)提示，在特定條件下，芬太尼作用于乳腺癌細(xì)胞時(shí)有可能出現(xiàn)不同的生物學(xué)表現(xiàn)。比如，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞中YAP高表達(dá)時(shí)，芬太尼可能激活YAP，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。

YAP的激活主要通過(guò)Hippo信號(hào)通路、機(jī)械應(yīng)力、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號(hào)通路、蛋白質(zhì)相互作用以及轉(zhuǎn)錄后修飾等途徑調(diào)控[8]。當(dāng)YAP被磷酸化后可被進(jìn)一步降解，是去其活性。只有去磷酸化的YAP可以進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合TEAD并活化下游靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等作用，調(diào)節(jié)器官大小、參與腫瘤形成[7]?，F(xiàn)研究不斷發(fā)現(xiàn)，YAP的激活受到多種細(xì)胞外分子的調(diào)控，包括LPA、葡糖糖、胰高血糖素、腎上腺素、S1P、凝血酶、雌激素等[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼也可以調(diào)控YAP的活化，其調(diào)控機(jī)制為GPCR信號(hào)通路，即芬太尼-MOR-Gi-YAP信號(hào)通路。本研究再次豐富了YAP調(diào)控的細(xì)胞外信號(hào)分子。

相同的信號(hào)通路可以根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、所處位置及周?chē)h(huán)境不同發(fā)揮多種調(diào)控作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)芬太尼抑制了乳腺癌的增殖并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，但在機(jī)制研究中，芬太尼可以通過(guò)使YAP去磷酸化而活化YAP，促進(jìn)其下游抗凋亡蛋白Survivin和BCL2的表達(dá)，從而具有促進(jìn)成瘤作用。但當(dāng)敲除YAP后這種促進(jìn)成瘤作用消失，說(shuō)明只有在特定條件下(如YAP高表達(dá))，芬太尼才具有潛在的促進(jìn)乳腺癌成瘤的作用。此外，也有研究顯示，阿片類(lèi)藥物可以通過(guò)AKT-NFκB信號(hào)通路抑制乳腺癌干細(xì)胞性和EMT從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[21]，同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芬太尼可抑制乳腺癌形成[22]，這些結(jié)果表明，芬太尼通過(guò)不同信號(hào)通路在乳腺癌中發(fā)揮不同的作用，而本研究進(jìn)一步證實(shí)抑制YAP后可促進(jìn)芬太尼誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡，為芬太尼在乳腺癌鎮(zhèn)痛治療中的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。