張喆,李依潔,魏瑋,劉瑜,符思,蘇曉蘭

1.中日友好醫(yī)院中醫(yī)脾胃病科，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院脾胃病科

腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)是一組持續(xù)或間歇發(fā)作，以腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和(或)大便性狀改變?yōu)榕R床表現(xiàn)，而缺乏胃腸道結(jié)構(gòu)和生化異常的腸道功能紊亂性疾病[1]，通過前期研究[2]發(fā)現(xiàn)針對(duì)IBS-D脾腎陽虛證制定的溫腎健脾方中高劑量組通過調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)、改善胃腸道激素紊亂、降低內(nèi)臟高敏感等方面起到了改善腹瀉的作用，本次研究擬通過蛋白組學(xué)研究挖掘脾腎陽虛證IBS-D大鼠蛋白質(zhì)的表達(dá)特征及溫腎健脾方中、高劑量組可能的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡(70 g)雄性SD大鼠50只，級(jí)別SPF/VAF，許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004，購自斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。恒溫(23～25 ℃)飼養(yǎng)，燈光環(huán)境和避光各12 h，大鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0038。

1.2 主要試劑及儀器 水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140827)；甲醛(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：YZB/京0099-2011)；番瀉葉(北京康美藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：140181491)；尿素(Bio-Rad，貨號(hào)：161-0731，美國(guó))；蛋白定量染液(Thermo Scientific，貨號(hào)：23238，美國(guó))；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(Sigma-Aldrich，貨號(hào)：A2058，美國(guó))；Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2 μg)。

U-TvO.5xC.24H01726顯微鏡(OLYMPUS公司)；RM2255切片機(jī)(Lejca公司)；H1122Q烤片機(jī)(Leica公司)；Eql50H脫水機(jī)(Lelca公司)；10K超濾管(Sartorious，PN：VN01H02)；6標(biāo)TMT?試劑盒(TMTsixplex Label Reagent Set)(Thermo Scientific Pierce，PN：90066)；超聲波細(xì)胞破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司，型號(hào)：XO)；酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)：Multiskan MK3)；真空冷凍干燥機(jī)(Thermo，型號(hào)：SPD2010-230)；RIGOL L-3000高效液相色譜系統(tǒng)(北京普源精電科技有限公司)；高效液相色譜儀(Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC)；質(zhì)譜系統(tǒng)(Thermo，型號(hào)：Q-Exactive)。

1.3 藥物制備 溫腎健脾顆粒劑：肉豆蔻15 g、補(bǔ)骨脂30 g、五味子9 g、吳茱萸9 g、黨參30 g、白術(shù)15 g、郁金18 g、生姜10 g、大棗10 g。以上藥物均購自望京醫(yī)院，由四川新綠藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司制備為顆粒劑，每劑146 g，經(jīng)沸水沖溶后置涼使用。

1.4 方法

1.4.1 分組與干預(yù)方法 50只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只為健康對(duì)照組(N組)，其余各組參考前期研究[3]，以AL-ChaerED[4]的造模方法為基礎(chǔ)，同時(shí)予番瀉葉灌胃聯(lián)合夾尾刺激，即采用物理化學(xué)刺激共同作用的方法制備脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型。N組全過程正常飼養(yǎng)，無造模及其他干預(yù)。造模大鼠進(jìn)行為期4周的造模干預(yù)后，N組與造模大鼠各隨機(jī)取1只大鼠行腸道病理組織學(xué)觀察。再參考存活數(shù)量，將造模組剩余大鼠隨機(jī)分為模型組(M組)、溫腎健脾方中劑量組(ZZ組)、溫腎健脾方高劑量組(ZG組)和西藥組(W組)4組，其中ZZ組、ZG組分別給予3.10、1.55 g·kg-1·d-1的溫腎健脾方顆粒灌胃，2 mL/次，2次/d；W組予匹維溴銨(公司名稱：Abbott Products SAS，生產(chǎn)批號(hào)：635518)以1.61 mg·kg-1·d-1灌胃，2 mL/次，2次/d；M組予等容量蒸餾水灌胃；干預(yù)周期14 d。

1.4.2 蛋白質(zhì)提取、定量 采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度[5]。蛋白定量后將200 μg蛋白溶液放于離心管中進(jìn)行蛋白酶切，脫鹽后采用Nanodrop測(cè)定各樣品中肽段的含量。分別取N組、M組、ZZ組、ZG組和W組大鼠距肛緣8 cm以上的結(jié)腸組織，每組做3只大鼠為生物重復(fù)，采用TMT sixplex Isobaric Mass Tagging Kit(Thermo Scientific)試劑進(jìn)行蛋白標(biāo)記，取等量所有實(shí)驗(yàn)樣品混合樣作為參考組Pool樣品。將標(biāo)記后的樣品混合，用RIGOLL-3000高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行肽段樣品預(yù)分，共得到15個(gè)合并組分。Nanodrop測(cè)定每個(gè)組分的肽段濃度。使用臺(tái)式四級(jí)桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q Exactive進(jìn)行反相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，液相色譜為EASY-nLC1000。質(zhì)譜原始文件由 Proteome Discoverer(版本1.4.0.288，Thermo Scientific)進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫為Uniprot大鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(50 837 個(gè)蛋白序列，2013-06)及污染庫(215 蛋白序列)。

1.4.3 生物信息學(xué)分析 使用DAVID生物信息學(xué)資源6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)和PANTHER 在線網(wǎng)站，進(jìn)行Gene Ontology(GO)注釋、蛋白的細(xì)胞定位和生物學(xué)過程等分析，根據(jù)P值選取富集顯著性排序前十位的注釋項(xiàng)。蛋白功能通路利用 KEGG數(shù)據(jù)庫獲得。

2 結(jié)果

2.1 基本鑒定信息 3次重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)合并后發(fā)現(xiàn)，最終鑒定確定了7 934個(gè)蛋白，總肽段數(shù)為69 261個(gè)，獨(dú)有的肽段序列數(shù)59 350，匹配的圖譜數(shù)為267 247。

2.2 數(shù)據(jù)篩選 在每個(gè)3次重復(fù)試驗(yàn)中，至少2次檢測(cè)到，同時(shí)入選的蛋白需要至少2個(gè)獨(dú)有的肽段序列數(shù)；為了提高數(shù)目的使用率，對(duì)于只有1個(gè)獨(dú)有的肽段序列數(shù)的蛋白質(zhì)，如果該肽段在所有的樣品中都能檢測(cè)到，那么我們也將對(duì)該蛋白進(jìn)行定量分析；經(jīng)篩選后，列表蛋白縮減為6 523個(gè)。然后在感興趣的組之間做Studentt檢驗(yàn)，P<0.05的蛋白認(rèn)為是差異表達(dá)的蛋白，在差異蛋白列表以“+”標(biāo)出，同時(shí)計(jì)算出該蛋白ratio的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，這樣共鑒定到405個(gè)差異蛋白。

405個(gè)差異蛋白中，以ratio倍數(shù)改變>1.2或<0.8，在M組與N組相比的差異蛋白中篩選明顯上調(diào)或下調(diào)的蛋白，共有163個(gè)，包括81個(gè)上調(diào)蛋白和82個(gè)下調(diào)蛋白；進(jìn)一步挖掘這163個(gè)差異蛋白，確定經(jīng)治療后ratio在1.2到0.8之間的蛋白存在回歸趨勢(shì)，篩選后發(fā)現(xiàn)ZZ組、ZG組、W組分別有79、18、117個(gè)蛋白有回歸趨勢(shì)，即經(jīng)治療后蛋白水平與N組相當(dāng)，包括上調(diào)蛋白71個(gè)、下調(diào)蛋白67個(gè)。

2.3 差異蛋白的功能分析 利用 PANTHER 在線軟件(http：//www.pantherdb.org/)，針對(duì)405個(gè)差異蛋白進(jìn)行功能分析，通過DAVID網(wǎng)站對(duì)具有差異的功能分析(P<0.05)進(jìn)行進(jìn)一步闡釋，包括蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecular functions)和細(xì)胞定位(cellular components)。分析結(jié)果所示，差異蛋白行使的主要生物學(xué)功能有：細(xì)胞構(gòu)成或合成、細(xì)胞的過程、定位、繁殖、生物調(diào)節(jié)、對(duì)刺激的反應(yīng)、發(fā)展的過程、多細(xì)胞生物過程、運(yùn)動(dòng)、生物黏附、代謝過程、生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的過程，其中涉及代謝途徑、細(xì)胞過程、細(xì)胞構(gòu)成和定位方面的達(dá)70%以上；示差異蛋白涉及的分子功能主要包括結(jié)合及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、受體、結(jié)構(gòu)分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、通道調(diào)節(jié)、催化和轉(zhuǎn)運(yùn)等活性調(diào)節(jié)功能，其中催化活性、結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性為主要功能，占90%；差異蛋白在細(xì)胞定位方面主要定位于細(xì)胞連接、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞的一部分、細(xì)胞器和胞外區(qū)，其中細(xì)胞部分、細(xì)胞器和大分子復(fù)合物占80%以上。

2.4 差異蛋白的KEGG通路分析 采用DAVID網(wǎng)站分析405個(gè)差異蛋白在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中的富集情況，提示了最相關(guān)的6個(gè)通路的蛋白數(shù)量(P<0.05，且比值>3%)，包括：代謝途徑(54)、核糖體(15)、氧化磷酸化(14)、阿爾茨海默病(14)、亨廷頓病(14)和剪接體(11)。

2.5 根據(jù)主要通路篩選重點(diǎn)差異蛋白 從6個(gè)主要信號(hào)通路涉及的差異蛋白中，篩選在M組/N組差異較大(ratio>1.2或<0.8)，并于ZZ組或ZG組治療后有回歸趨勢(shì)(ratio在1.2至0.8之間)的蛋白，總結(jié)其在各組表達(dá)的情況。發(fā)現(xiàn)共涉及16個(gè)差異蛋白：Ugt1a1、Alad、Naprt1、Cox6b1、Mccc2、Naglu、Acss2、Man2a1、Mrpl14、Mrpl12、Mrpl2、Gsk3b、Tgm2、Srsf6、Wbp11和Snrpd2；Naprt1、Naglu、Mrpl2在ZG組表現(xiàn)出回歸趨勢(shì)，除了Naglu的其余15個(gè)蛋白均在ZZ組表現(xiàn)出回歸趨勢(shì)：蛋白Cox6b1同時(shí)存在于代謝途徑、氧化磷酸化、阿爾茨海默病和亨廷頓病4條通路(見表1)。

表1 主要通路中表達(dá)重點(diǎn)差異蛋白

3 討論

本研究所選用的對(duì)照西藥為匹維溴銨，是一種鈣通道阻斷性季銨化合物[6]，可改善運(yùn)動(dòng)障礙、降低內(nèi)臟敏感性，是針對(duì)IBS腹痛、排便紊亂等不適有公認(rèn)療效的解痙藥[7]。參照匹維溴銨既往的治療機(jī)制和蛋白組學(xué)研究，分析全部405個(gè)差異蛋白后發(fā)現(xiàn)，ZZ組和W組共同回歸的蛋白有65個(gè)，占到ZZ組回歸蛋白的82.28%，提示了溫腎健脾方臨床劑量(ZZ組)的治療機(jī)制與匹維溴銨有高度的相似性。

通過研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)從蛋白組學(xué)的角度各組差異蛋白主要影響了6條相關(guān)信號(hào)通路。在分析代謝途徑信號(hào)通路時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)在該通路主要涉及脂質(zhì)代謝和多聚糖生物合成與代謝2種。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，其中有8個(gè)蛋白經(jīng)造模后與正常組出現(xiàn)較大差異并于中藥治療后差異縮小回歸正常水平：Ugt1a1、Alad、Naprt1、Cox6b1、Mccc2、Naglu、Acss2、Man2a1，以上這些蛋白與胃腸道腫瘤、膽紅素代謝、鉛中毒腎損害、脂肪酸合成、腫瘤應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等方面相關(guān)性較強(qiáng)，但目前文獻(xiàn)中均未發(fā)現(xiàn)它們與IBS發(fā)病和治療的相關(guān)性研究。氧化磷酸化通路、核糖體通路的相關(guān)蛋白與代謝途徑信號(hào)通路情況類似，相關(guān)主要蛋白在目前研究進(jìn)展中未發(fā)現(xiàn)與IBS發(fā)病和治療的明顯相關(guān)性。

從其他差異蛋白來看可能與腦腸互動(dòng)和腸道慢性炎癥的病理因素相關(guān)性較高。本組在分析阿爾茨海默病通路時(shí)發(fā)現(xiàn)其中的糖原合成激酶-3βGsk3b為絲/蘇氨酸磷酸激酶的B型亞基，該基因分布廣泛并與多種疾病病機(jī)有關(guān)，如阿爾茨海默病及帕金斯綜合征、腫瘤、骨骼發(fā)育和新陳代謝、肥胖和2型糖尿病等[8]。阿爾茨海默病的特征之一是微管相關(guān)蛋白tau的異常磷酸化，而GSK3b是引起其磷酸化的重要蛋白——過表達(dá)的GSK3b會(huì)降低細(xì)胞核β-catenin的表達(dá)，引起tau的過度磷酸化和大腦神經(jīng)退行性改變。此外，GSK3b可通過負(fù)調(diào)控IL-17的信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而抑制炎癥相關(guān)通路的因子[9-10]。

基于IBS有腦腸互動(dòng)和腸道慢性炎癥的病理因素，結(jié)合本研究中蛋白的表達(dá)趨勢(shì)，推斷M組大鼠由于造模影響引起Gsk3b表達(dá)增高，考慮可能降低了β-catenin的表達(dá)、引起tau的過度磷酸化和腦神經(jīng)的異常改變；而治療后該蛋白表達(dá)下降，表現(xiàn)出回歸正常趨勢(shì)，可能是通過調(diào)控β-catenin的表達(dá)，維持了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的穩(wěn)定，進(jìn)一步可保障腸道黏膜和神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，或通過調(diào)控IL-17的信號(hào)級(jí)聯(lián)，抑制炎癥因子的作用，從而減少了腸道炎癥。

在亨廷頓病通路中的組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(Tgm2)，產(chǎn)生于小腸上皮細(xì)胞，研究證實(shí)為乳糜瀉和精神分裂癥的易感因子。而乳糜瀉在IBS患者中的發(fā)病率高于健康人4～7倍[11]，而Tgm2引起乳糜瀉和精神分裂癥的機(jī)制均與醇溶蛋白(Gliadin)相關(guān)[12]。醇溶蛋白為小麥面筋蛋白的部分組成，其對(duì)消化酶具有強(qiáng)耐受性，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激、感染等情況時(shí)，引起腸道通透性異常，未消化的蛋白片段則進(jìn)入機(jī)體，由于Tgm2與醇溶蛋白有極高親和力，它通過脫氨基和酰胺基轉(zhuǎn)移等改變了醇溶蛋白片段，繼而產(chǎn)生抗Tgm2抗體，醇溶蛋白來源的抗原表位誘發(fā)了精神分裂癥[13]，具體機(jī)制尚不明確，而抗Tgm2抗體導(dǎo)致了乳糜瀉。近年來，低FODMAP飲食作為IBS的治療方式得到公認(rèn)[14]，其機(jī)制正是由于IBS患者腹部癥狀的產(chǎn)生與醇溶蛋白引起的免疫反應(yīng)有關(guān)。而Tgm2在腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的雙重作用，均提示了其在IBS發(fā)病中可能存在的重要意義。在本研究中，M組大鼠經(jīng)歷造模中應(yīng)激等因素的刺激，可能影響了腸道通透性的改變，促進(jìn)了醇溶蛋白的攝入，引起Tgm2表達(dá)上調(diào)，增加了抗Tgm2抗體并誘發(fā)了相關(guān)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)了IBS的產(chǎn)生；而治療后Tgm2下調(diào)，提示了在減輕免疫應(yīng)答、減少異體蛋白抗體等方面產(chǎn)生了作用。

IBS為功能性疾病，腦腸互動(dòng)為其重要病機(jī)發(fā)現(xiàn)，提示IBS發(fā)病過程與中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切；因而，基因剪切通路的研究對(duì)IBS也意義重大。有研究[15]顯示，多聚谷氨酰胺結(jié)合蛋白1(pqbp1)為重要的RNA剪切因子，而剪接體通路中WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白11(Wbp11)作為其結(jié)合因子可約束其突變，防止相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生；同時(shí)，這2個(gè)基因的表達(dá)異常會(huì)引起胚胎時(shí)中胚層和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育異常，并誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷。另有研究[16]證實(shí)，部分敲除小鼠pqbp1基因后發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出明顯的焦慮認(rèn)知損害和心理發(fā)育遲緩，而Wbp11的表達(dá)與pqbp1的功能極為密切，甚至認(rèn)為保證Wbp11功能正常是pqbp1正確表達(dá)的唯一關(guān)鍵。除了對(duì)神經(jīng)的調(diào)節(jié)，Wbp11也調(diào)控胃腸道功能的變化。研究[17]發(fā)現(xiàn)，NOD2蛋白所屬家族可調(diào)控腸黏膜與共生菌的炎癥反應(yīng)，該蛋白則有助于先天免疫反應(yīng)形成和保持腸黏膜平衡。

本次研究中還發(fā)現(xiàn)蛋白Cox6b1同時(shí)存在于代謝途徑、氧化磷酸化、阿爾茨海默病和亨廷頓病4條通路。經(jīng)藥物治療后該蛋白的下調(diào)趨勢(shì)得以回歸，提示了其對(duì)IBS中腸神經(jīng)系統(tǒng)和腸道運(yùn)動(dòng)功能可能存在調(diào)控影響。

本研究所用溫腎健脾方，由肉豆蔻、補(bǔ)骨脂、五味子、吳茱萸、黨參、白術(shù)、郁金、生姜、大棗組成。從中醫(yī)理論出發(fā)可以補(bǔ)脾胃、化水谷、升清陽、除腹瀉，又能充腎陽、固大腸。通過本研究發(fā)現(xiàn)ZZ組藥物在維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)方面的突出作用，尤其阿爾茨海默病、亨廷頓病通路的影響更能體現(xiàn)這一點(diǎn)。單純檢索組成藥物的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，在維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)方面，肉豆蔻揮發(fā)油通過調(diào)節(jié)五羥色胺及單胺氧化酶有抗抑郁作用[18]，北五味子多糖通過減少腦組織中谷氨酸含量有抗焦慮和鎮(zhèn)靜催眠作用[19]，而白術(shù)多糖具有延緩神經(jīng)細(xì)胞因缺氧復(fù)氧而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的能力[20]，盡管這些單藥在復(fù)方結(jié)構(gòu)中與本次研究結(jié)果是否存在相關(guān)性，但它們?nèi)蕴崾玖藴啬I健脾方在維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)方面的作用值得進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。